Gekoppeld Testen voor Monitoring Protein Refolding in<em> Saccharomyces cerevisiae</em
Summary
Dit artikel beschrijft het gebruik van een vuurvlieg luciferase-GFP-fusie-eiwit te onderzoeken<em> In vivo</em> Eiwitvouwing in<em> Saccharomyces cerevisiae</em>. Met behulp van dit reagens, hervouwing van een model warmte-gedenatureerde proteïne kan gelijktijdig monitoren van fluorescentie microscopie en een enzymatische assay om de rol van proteostasis netwerkcomponenten eiwit kwaliteitscontrole sonde.
Abstract
Proteostasis, gedefinieerd als de gecombineerde processen van het vouwen van eiwitten / biogenese, heropvouw / reparatie, en degradatie, is een delicate cellulaire evenwicht dat moet worden gehandhaafd om schadelijke gevolgen te vermijden 1. Externe of interne factoren die dit evenwicht verstoren kan leiden tot aggregatie van eiwitten, toxiciteit en celdood. Bij mensen is dit een belangrijke factor voor de symptomen van neurodegeneratieve aandoeningen zoals Huntington, Parkinson en Alzheimer ziekten 10. Het is daarom essentieel dat de bij het onderhoud van proteostasis eiwitten om behandelingen voor deze slopende ziekten ontwikkelen geïdentificeerd. Dit artikel beschrijft technieken voor het toezicht op in-vivo vouwen van eiwitten in bijna realtime resolutie met behulp van het model eiwit vuurvliegluciferase gefuseerd met groen fluorescerend eiwit (FFL-GFP). FFL-GFP is een uniek model chimeer eiwit als FFL groep zeer gevoelig voor stress-geïnduceerde misfolding en aggregatie, die het enzym 12 inactiveert. Luciferase activiteit wordt bewaakt door middel van een enzymatisch assay, en de GFP-groep een werkwijze van het visualiseren van oplosbare of geaggregeerd FFL middels geautomatiseerde microscopie. Deze combinatie methoden rekening gehouden twee parallelle en technisch onafhankelijke benaderingen van zowel heropvouwing en functionele reactivering van een enzym na spanning te analyseren. Activiteit herstel kan direct worden gecorreleerd met de kinetiek van disaggregatie en opnieuw oplossen om beter te begrijpen hoe eiwitten kwaliteitscontrole factoren zoals eiwitten chaperonnes samenwerken om deze functies uit te voeren. Bovendien kan gendeleties of mutaties worden inbreng van specifieke eiwitten of subeenheden om dit proces te testen. In dit artikel onderzoeken we de bijdrage van het eiwit disaggregase Hsp104 13, bekend om samen met de Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding systeem 5, aan eiwit opnieuw vouwen om deze aanpak te valideren.
Introduction
Bij mensen neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer, Parkinson en Huntington ziekten zijn verbonden met eiwit misfolding en aggregatie 10. Cellen in dienst moleculaire chaperonnes in kinetische vangst van cellulaire eiwitten in misgevouwen inactieve structuren 6 voorkomen. Chaperones deelnemen ingewikkelde wisselwerking netwerken binnen de cel, maar is niet volledig duidelijk hoe de som van deze interacties bijdraagt tot organismale proteostasis. Een van de belangrijkste chaperonnes verantwoordelijk voor de meerderheid van de cytosolische eiwitten vouwen is het 70 kD heat shock protein (hsp70) family 19. Er is aangetoond dat in gist verlies van Hsp70 daalt de mogelijkheid ontluikende heteroloog tot expressie FFL vouwen en het endogene eiwit, ornithine transcarbamoylase, hervouwen in vivo 18, 7. Het vermogen om te vouwen analyseren met bijna realtime resolutie zal het wederzijds begrip hoe de extra cellulaire factoren contribute deze Hsp70-afhankelijk proces. Bovendien vouwen / hervouwing reacties kunnen niet volledig afhankelijk van deze eiwitten dragen, zodat assays zijn gevoelig genoeg om zowel grote als kleine veranderingen detecteren in kinetiek en efficiency.
De gistcel disaggregase, Hsp104, speelt een belangrijke rol bij het herstel geaggregeerde verkeerd gevouwen eiwitten. Hoewel Hsp104 homologen geïdentificeerd in schimmels en planten, lijkt dit gezin afwezig in metazoans. Er is voorgesteld dat andere chaperones zoals die van de familie Hsp110 voeren wat de bekende Hsp104 activiteiten bij zoogdieren 16. Hsp104 is een AAA +, hexamere eiwitcomplex dat functies in gist te verbouwen eiwitcomplexen, die bijdragen tot het opnieuw vouwen en reparatie 13. Hsp104, samen met de gist Hsp70, SSA1 en de gist Hsp40, Ydj1, vereist voor het herstel van gedenatureerd FFL in gistcellen 5, 8. The small heat shock eiwit Hsp26, is ook aangetoond dat requirood voor Hsp104-gemedieerde uitsplitsing van FFL 2.
FFL is een twee-domein eiwit dat het substraat luciferine in de actieve plaats en na een conformationele verandering die ATP en zuurstof, decarboxyleert vereist bindt het substraat los oxyluciferine, koolstofdioxide (CO 2), adenosine monofosfaat (AMP), en lichte 11, 9, 3. De commercieel beschikbare FFL substraat D-luciferine resulteert in lichtemissie tussen 550-570 nm die kunnen worden gedetecteerd met behulp van een lichtmeter 15. FFL is uiterst gevoelig voor denaturatie van chemische of thermische behandelingen en aggregaten snel na ontvouwen. Bij blootstelling aan temperaturen tussen 39-45 ° C FFL is reversibel ontvouwen en geïnactiveerd 12. In tegenstelling, GFP en derivaten daarvan zijn zeer resistent tegen eiwitten ontvouwen spanningen 14. Daarom fusie van deze twee eiwitten kunnen FFL gefunctioneerd als experimenteel labiele groep die zich richten functionele GFP aan deposito's die kunnen worden gevisualiseerd met behulp van fluorescentie microscopie op zowel de bevolking en single cell niveau intracellulaire. Toepassing van de enzymatische assay in een semi-automatische multimode plaatlezer combinatie met geautomatiseerde microscopie kunnen ongekende gelijktijdige beoordeling kinetiek en opbrengst van hervouwing reacties. Bovendien, de gemakkelijke moleculaire genetica van het model Saccharomyces cerevisiae kunnen zowel nauwkeurige manipulatie van het eiwit kwaliteitscontrole netwerk en de mogelijkheid voor ontdekking benaderingen om nieuwe spelers dragen tot cellulaire stressrespons en proteostasis identificeren.
In deze studie, wild-type (WT) en Hsp104 deletiestammen uiten FFL-GFP zijn onderhevig aan eiwitten denatureren heat shock. FFL-GFP refolding wordt bewaakt door middel van zowel een enzymatische assay en microscopie als een proxy uitlezing voor reparatie van het proteoom geuit over een hersteltijd cursus. In vergelijking met WT cellen, tonen we the Hsp104 deletiestam is ~ 60% minder efficiënt bij refolding FFL-GFP, het ondersteunen eerdere bevindingen tot vaststelling van een rol voor Hsp104 bij reactivering van gedenatureerde FFL 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit artikel wordt het model eiwit FFL-GFP werd aangetoond dat de gist disaggregase, Hsp104 bij aan eiwit opnieuw oplossen en reparatie. De enzymatische assays en microscopie differentieel ondervraagd de status van hetzelfde substraat proteïne hervouwing efficiëntie en opbrengst te bepalen. Resultaten van de enzymatische assays recovery voor dat niet alleen de maximale herstel van de hsp104D mutante stam inefficiënt, maar de aanvankelijke omvang van het ontvouwen spanning hoger was in de mutant (fi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Institutes of Health (NIGMS-074696) om KAM en een American Society of Microbiology Robert D. Watkins Graduate Student Research Fellowship aan JLA We danken ook John Glover aan de Universiteit van Toronto voor het verstrekken van de FFL source-GFP plasmide.
Materials
| Reagents | |||
| Synergy MX Microplate Reader | BioTek | ||
| Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope | Olympus, Tokyo Japan | ||
| Lumitrac 200 white 96-well plates | USA Scientific | ||
| SlideBook 5.0 digital microscopy software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA | ||
| Equipment | |||
| Tris Base | Fisher | BP152-1 | |
| (LiAc) Lithium Acetate | Sigma | L6883 | |
| PEG (polyethelene glycol) | Fisher | BP233-1 | |
| EDTA | Fisher | BP120-1 | |
| DMSO | Malinckrodt | 4948 | |
| SC | Sunrise | 1300-030 | |
| SC-URA | Sunrise | 1306-030 | |
| cycloheximide | Acros Organics | 357420050 | |
| D-luciferin | Sigma | L9504 | |
| low melt agarose | NuSieve | 50082 | |
| immersion oil | Cargille | 16484 |
Referências
- Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
- Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104. J. Biol. Chem. 280, 23869-23875 (2005).
- Conti, E., Lloyd, L. F., Akins, J., Franks, N. P., Brick, P. Crystallization and preliminary diffraction studies of firefly luciferase from Photinus pyralis. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 52, 876-878 (1996).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11, 355-360 (1995).
- Glover, J. R., Lindquist, S. Hsp104, Hsp70, and Hsp40: a novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins. Cell. 94, 73-82 (1998).
- Grantcharova, V., Alm, E. J., Baker, D., Horwich, A. L. Mechanisms of protein folding. Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 70-82 (2001).
- Kim, S., Schilke, B., Craig, E. A., Horwich, A. L. Folding in vivo of a newly translated yeast cytosolic enzyme is mediated by the SSA class of cytosolic yeast Hsp70 proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 12860-12865 (1998).
- Lum, R., Niggemann, M., Glover, J. R. Peptide and protein binding in the axial channel of Hsp104. Insights into the mechanism of protein unfolding. J. Biol. Chem. 283, 30139-30150 (2008).
- Marques, S. M., Esteves da Silva, J. C. Firefly bioluminescence: a mechanistic approach of luciferase catalyzed reactions. IUBMB Life. 61, 6-17 (2009).
- Morimoto, R. I. The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 76, 91-99 (2011).
- Nakatsu, T., et al. Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence. Nature. 440, 372-376 (2006).
- Nathan, D. F., Vos, M. H., Lindquist, S. In vivo functions of the Saccharomyces cerevisiae Hsp90 chaperone. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 12949-12956 (1997).
- Parsell, D. A., Kowal, A. S., Singer, M. A., Lindquist, S. Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hsp104. Nature. 372, 475-478 (1994).
- Penna, T. C., Ishii, M., Junior, A. P., Cholewa, O. Thermal stability of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) at various pH values. Appl. Biochem. Biotechnol. , 113-116 (2004).
- Seliger, H. H., Buck, J. B., Fastie, W. G., McElroy, W. D. The Spectral Distribution of Firefly Light. J. Gen. Physiol. 48, 95-104 (1964).
- Shorter, J. The mammalian disaggregase machinery: Hsp110 synergizes with Hsp70 and Hsp40 to catalyze protein disaggregation and reactivation in a cell-free system. PLoS One. 6, e26319 (2011).
- Tkach, J. M., Glover, J. R. Nucleocytoplasmic trafficking of the molecular chaperone Hsp104 in unstressed and heat-shocked cells. Traffic. 9, 39-56 (2008).
- Unno, K., Kishido, T., Hosaka, M., Okada, S. Role of Hsp70 subfamily, Ssa, in protein folding in yeast cells, seen in luciferase-transformed ssa mutants. Biol. Pharm. Bull. 20, 1240-1244 (1997).
- Verghese, J., Abrams, J., Wang, Y., Morano, K. A. Biology of the heat shock response and protein chaperones: budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) as a model system. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76, 115-158 (2012).
