Saggi accoppiati per il monitoraggio delle proteine in ripiegamento<em> Saccharomyces cerevisiae</em
Summary
Questo articolo descrive l'uso di una proteina di fusione GFP-luciferasi lucciola per indagare<em> In vivo</em> Folding delle proteine in<em> Saccharomyces cerevisiae</em>. Usando questo reagente, ripiegamento di una proteina modello denaturato al calore può essere monitorato contemporaneamente mediante microscopia a fluorescenza e un saggio enzimatico per sondare i ruoli dei componenti di rete proteostasis nel controllo di qualità delle proteine.
Abstract
Proteostasis, definiti come i processi combinati di proteine pieghevole / biogenesi, ripiegamento / riparazione, e il degrado, è un delicato equilibrio cellulare che deve essere mantenuta per evitare conseguenze deleterie 1. Fattori esterni o interni che sconvolgono questo equilibrio può portare ad aggregazione proteica, la tossicità e la morte cellulare. Negli esseri umani questo è un fattore importante che contribuisce ai sintomi associati a patologie neurodegenerative come la corea di Huntington, il morbo di Parkinson e il morbo di Alzheimer 10. È pertanto essenziale che le proteine coinvolte nel mantenimento di proteostasis essere identificati per sviluppare trattamenti per queste malattie debilitanti. In questo articolo vengono descritte le tecniche per il monitoraggio de ripiegamento delle proteine vivo a risoluzione quasi in tempo reale utilizzando il modello di proteina lucciola luciferasi fusa alla proteina fluorescente verde (GFP-FFL). FFL-GFP è una proteina chimerica modello unico come la frazione FFL è estremamente sensibile allo stress indotto misfolding e aggregazione, che inattiva l'enzima 12. Attività di luciferasi è monitorata utilizzando un saggio enzimatico, e la frazione GFP fornisce un metodo di visualizzazione FFL solubile o aggregate utilizzando la microscopia automatizzata. Questi metodi accoppiati incorporano due approcci paralleli e tecnicamente indipendenti per analizzare sia ripiegamento e riattivazione funzionale di un enzima dopo stress. Attività di recupero può essere direttamente correlata con la cinetica di disaggregazione e ri-solubilizzazione per capire meglio come proteine fattori di controllo di qualità come chaperon proteine collaborano per eseguire queste funzioni. Inoltre, delezioni o mutazioni geniche possono essere usati per testare contributi di proteine specifiche o subunità proteiche a questo processo. In questo articolo esaminiamo i contributi della proteina disaggregase Hsp104 13, nota di collaborare con il fattore di scambio Hsp40/70/nucleotide (NEF) Sistema 5 ripiegamento, di ripiegamento delle proteine per validare questo approccio.
Introduction
Negli esseri umani malattie neurodegenerative tra cui l'Alzheimer, il Parkinson e le malattie di Huntington sono stati collegati a misfolding e aggregazione 10. Le cellule impiegano chaperon molecolari per prevenire intrappolamento cinetica delle proteine cellulari in strutture inattive mal ripiegate 6. Accompagnatori partecipano a reti di interazione complessi all'interno della cellula, ma non è completamente noto come la somma di queste interazioni contribuisce a proteostasis organismal. Uno degli accompagnatori principali responsabili della maggior parte dei citosolica ripiegamento delle proteine è il 70 kD proteina da shock termico (Hsp70) famiglia 19. È stato dimostrato che la perdita di lievito Hsp70 diminuisce la capacità di piegare nascente FFL heterologously espresso e ripiegare la proteina endogena, ornitina transcarbamoylase, in vivo 18, 7. La capacità di analizzare pieghevole con risoluzione tempo quasi reale faciliterà la comprensione di come ulteriore fattori cellulari contribute a questo processo Hsp70-dipendente. Inoltre, piegatura / ripiegamento reazioni potrebbe non essere completamente dipendente da queste proteine che contribuiscono, in modo dosaggi devono essere abbastanza sensibile per rilevare piccole e grandi cambiamenti nella cinetica e di efficienza.
Il disaggregase cellula di lievito, Hsp104, svolge un ruolo fondamentale nella riparazione di proteine mal ripiegate aggregati. Sebbene Hsp104 omologhi sono stati identificati in funghi e piante, questa famiglia sembra essere assente in metazoi. E 'stato proposto che altri chaperon come quelle della famiglia Hsp110 eseguire alcuni dei noti Hsp104 attività nei mammiferi 16. Hsp104 è un +, complesso proteico esamerica AAA che funziona in lievito di aggregati proteici rimodellare, contribuendo a ripiegamento e riparazione 13. Hsp104, insieme con il lievito Hsp70, Ssa1, e il lievito Hsp40, Ydj1, necessario per il ripristino di FFL denaturato in cellule di lievito 5, 8. La piccola proteina da shock termico, Hsp26, ha anche dimostrato di essere requirosso per disaggregazione Hsp104-mediata di FFL 2.
FFL è una proteina due dominio che lega il substrato luciferina nel sito attivo e seguendo un cambiamento conformazionale che richiede ATP e ossigeno, decarbossila il substrato rilasciando oxyluciferin, anidride carbonica (CO 2), adenosina monofosfato (AMP), e la luce 11, 9, 3. Il substrato disponibile in commercio FFL, D-luciferina, provoca emissione di luce tra 550-570 nm che possono essere rilevati usando un luminometro 15. FFL è squisitamente sensibile alla denaturazione da trattamenti chimici o di calore e aggrega rapidamente a dispiegarsi. Se esposto a temperature tra 39-45 ° C FFL è reversibile spiegato ed inattivato 12. In contrasto, GFP e suoi derivati sono altamente resistenti alla proteina dispiegarsi sollecitazioni 14. Pertanto fusione di queste due proteine permette FFL aver operato come frazione sperimentalmente labile in grado di colpire G funzionaleFP a intracellulare depositi che possono essere visualizzati mediante microscopia a fluorescenza sia la popolazione e livelli di cellule singole. Applicazione del saggio enzimatico in un lettore di piastre multimodale semi-automatico accoppiato con microscopia automatizzata consente la valutazione simultanea senza precedenti di cinetica e di rendimento di ripiegamento reazioni. Inoltre, la genetica molecolare facili del modello eucariote Saccharomyces cerevisiae consente sia precisa manipolazione della rete di controllo della qualità delle proteine e l'opportunità di approcci basati scoperta per identificare nuovi giocatori che contribuiscono alla risposta allo stress cellulare e proteostasis.
In questo studio, i ceppi wild-type (WT) e Hsp104 cancellazione esprimono FFL-GFP sono soggetti a denaturazione delle proteine da shock termico. FFL-GFP ripiegamento viene monitorata attraverso sia un saggio enzimatico e microscopia come visualizzatore proxy per la riparazione del proteoma espresso in un corso di tempo di ripristino. Se paragonato alle cellule WT, mostriamo the Hsp104 ceppo cancellazione è ~ 60% meno efficiente a ripiegamento FFL-GFP, sostenendo risultati precedenti che istituisce un ruolo per Hsp104 nella riattivazione di denaturato FFL 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo articolo l'proteina modello FFL-GFP è stato usato per dimostrare che il disaggregase lievito, Hsp104 contribuisce alla proteina re-solubilizzazione e riparazione. I saggi enzimatici e microscopia differenzialmente interrogato lo stato della stessa proteina substrato per determinare ripiegamento efficienza e la resa. Risultati dei saggi enzimatici recupero suggeriscono che non solo è il massimo recupero nel hsp104D ceppo mutante inefficiente, ma la grandezza iniziale della sollecitazione dispiega…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da parte del National Institutes of Health (NIGMS-074.696) per KAM e un American Society of Microbiology Robert D. Watkins Graduate Student Research Fellowship alla JLA Ringraziamo anche John Glover presso l'Università di Toronto per la fornitura del FFL -GFP plasmide sorgente.
Materials
| Reagents | |||
| Synergy MX Microplate Reader | BioTek | ||
| Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope | Olympus, Tokyo Japan | ||
| Lumitrac 200 white 96-well plates | USA Scientific | ||
| SlideBook 5.0 digital microscopy software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA | ||
| Equipment | |||
| Tris Base | Fisher | BP152-1 | |
| (LiAc) Lithium Acetate | Sigma | L6883 | |
| PEG (polyethelene glycol) | Fisher | BP233-1 | |
| EDTA | Fisher | BP120-1 | |
| DMSO | Malinckrodt | 4948 | |
| SC | Sunrise | 1300-030 | |
| SC-URA | Sunrise | 1306-030 | |
| cycloheximide | Acros Organics | 357420050 | |
| D-luciferin | Sigma | L9504 | |
| low melt agarose | NuSieve | 50082 | |
| immersion oil | Cargille | 16484 |
Referências
- Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
- Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104. J. Biol. Chem. 280, 23869-23875 (2005).
- Conti, E., Lloyd, L. F., Akins, J., Franks, N. P., Brick, P. Crystallization and preliminary diffraction studies of firefly luciferase from Photinus pyralis. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 52, 876-878 (1996).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11, 355-360 (1995).
- Glover, J. R., Lindquist, S. Hsp104, Hsp70, and Hsp40: a novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins. Cell. 94, 73-82 (1998).
- Grantcharova, V., Alm, E. J., Baker, D., Horwich, A. L. Mechanisms of protein folding. Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 70-82 (2001).
- Kim, S., Schilke, B., Craig, E. A., Horwich, A. L. Folding in vivo of a newly translated yeast cytosolic enzyme is mediated by the SSA class of cytosolic yeast Hsp70 proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 12860-12865 (1998).
- Lum, R., Niggemann, M., Glover, J. R. Peptide and protein binding in the axial channel of Hsp104. Insights into the mechanism of protein unfolding. J. Biol. Chem. 283, 30139-30150 (2008).
- Marques, S. M., Esteves da Silva, J. C. Firefly bioluminescence: a mechanistic approach of luciferase catalyzed reactions. IUBMB Life. 61, 6-17 (2009).
- Morimoto, R. I. The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 76, 91-99 (2011).
- Nakatsu, T., et al. Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence. Nature. 440, 372-376 (2006).
- Nathan, D. F., Vos, M. H., Lindquist, S. In vivo functions of the Saccharomyces cerevisiae Hsp90 chaperone. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 12949-12956 (1997).
- Parsell, D. A., Kowal, A. S., Singer, M. A., Lindquist, S. Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hsp104. Nature. 372, 475-478 (1994).
- Penna, T. C., Ishii, M., Junior, A. P., Cholewa, O. Thermal stability of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) at various pH values. Appl. Biochem. Biotechnol. , 113-116 (2004).
- Seliger, H. H., Buck, J. B., Fastie, W. G., McElroy, W. D. The Spectral Distribution of Firefly Light. J. Gen. Physiol. 48, 95-104 (1964).
- Shorter, J. The mammalian disaggregase machinery: Hsp110 synergizes with Hsp70 and Hsp40 to catalyze protein disaggregation and reactivation in a cell-free system. PLoS One. 6, e26319 (2011).
- Tkach, J. M., Glover, J. R. Nucleocytoplasmic trafficking of the molecular chaperone Hsp104 in unstressed and heat-shocked cells. Traffic. 9, 39-56 (2008).
- Unno, K., Kishido, T., Hosaka, M., Okada, S. Role of Hsp70 subfamily, Ssa, in protein folding in yeast cells, seen in luciferase-transformed ssa mutants. Biol. Pharm. Bull. 20, 1240-1244 (1997).
- Verghese, J., Abrams, J., Wang, Y., Morano, K. A. Biology of the heat shock response and protein chaperones: budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) as a model system. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76, 115-158 (2012).
