A<em> Caenorhabditis elegans</em> Modell-System für Amylopathy Study

Summary

Wir beschreiben Methoden, um Aspekte der amylopathies in der Schnecke zu studieren<em> C. elegans</em>. Wir zeigen, wie Würmer, die humane Aß konstruieren₄₂ In Neuronen und wie sie ihre Funktion in Verhaltens-Assays zu testen. Wir zeigen, wie man weiter primären neuronalen Kulturen, die für pharmakologische Tests verwendet werden können, zu erhalten.

Abstract

Amylopathy ist ein Begriff, der anomalen Synthese und Akkumulation von Amyloid-beta (Aß) im Gewebe mit der Zeit beschreibt. Aß ist ein Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit (AD) und wird in Lewy-Körper-Demenz, Einschlusskörperchenmyositis und zerebrale Amyloid-Angiopathie ^1-4 gefunden. Amylopathies schrittweise mit der Zeit entwickeln. Aus diesem Grund einfache Organismen mit kurzen Lebensdauer kann helfen, molekulare Aspekte dieser Bedingungen aufzuklären. Hier beschreiben wir experimentelle Protokolle zu Aß-vermittelte Neurodegeneration mit den Wurm Caenorhabditis elegans zu untersuchen. So konstruieren wir transgene Würmer durch Einspritzen kodierende DNA menschlichen Aß ₄₂ in die Syncytial Keimdrüsen von erwachsenen Hermaphroditen. Transformantenlinien werden durch eine Mutagenese-induzierte Integration stabilisiert. Nematoden sind Alter durch das Sammeln und Säen ihre Eier synchronisiert. Die Funktion der Neuronen, Aß ₄₂ ist in opportun Verhaltensstörungen Assays getestet (Chemotaxis Assays). Primäre neuronale Kulturen aus Embryonen gewonnen werden, um Verhaltensänderungen Daten zu ergänzen und die neuroprotektive Wirkung von anti-apoptotischen Verbindungen testen.

Introduction

Amyloid beta (Aß) ein Peptid mit 36-43 Aminosäuren, die nach sequentieller Spaltung des Amyloid-Vorläufer-Protein (APP) durch β und γ-Sekretase ¹ gebildet wird. Die γ-Sekretase verarbeitet die C-terminalen Ende der Aß-Peptid und ist verantwortlich für die variable Längen ^5. Die häufigsten Formen von Aß Aß sind ₄₀ und ₄₂ Aß, wobei letzteres häufiger pathologische Zustände wie AD ⁵ zugeordnet. Bei hohen Konzentrationen Aß Form β-Faltblättern, dass aggregieren zu bilden Amyloid-Fibrillen ^6. Fibrillen Ablagerungen sind der Hauptbestandteil der senilen Plaques umliegenden Neuronen. Beide Plaketten und diffusionsfähig, nicht-Plaque Aß-Oligomere, wird angenommen, dass die zugrunde liegenden pathogenen Formen von Aß darstellen.

Laboruntersuchung der neuronalen amylopathies wird durch die Tatsache, dass diese Bedingungen Zeitlicher Verlauf kompliziert. Daher ist es important zu genetisch manipulierbaren Tiermodellen komplementären entwickeln Mäuse-mit kurzen Lebensdauer. Diese Modelle können verwendet werden, um bestimmte Aspekte der amylopathies-Regel zellulären und molekularen und aufgrund ihrer Einfachheit dazu beitragen, das Wesen des Problems zu erfassen aufzuklären. Der Wurm Caenorhabditis elegans ist diese Kategorie fällt. Es hat eine kurze Lebensdauer, ~ 20 Tage und darüber hinaus grundlegende zelluläre Prozesse einschließlich der Regulierung der Genexpression, Protein-Trafficking, neuronale Konnektivität, Synaptogenese, Zellkommunikation und Tod sind ähnlich wie Säugetierzellen ^7. Einzigartige Merkmale des Wurms enthalten leistungsfähige Genetik und der Mangel an einem Schiff, das zu neuronalen Schäden unabhängig von Gefäßschäden studieren können. Andererseits begrenzt der Mangel eines Gehirns die Verwendung von C. elegans zu studieren viele Aspekte der Neurodegeneration. Darüber hinaus kann die Wiedergabe und Identifizierung der anatomischen Verteilung der Läsionen in diesem Organismus durchgeführt werden. Andere Limittionen wie die Schwierigkeit, sowohl Unterschiede in der Genexpression Profile und Wertminderungen von komplexen Verhalten und Memory-Funktion zu beurteilen. Hier beschreiben wir Methoden, um C zu erzeugen elegans Modelle amylopathies.

Protocol

1. Bau von transgenen Worms Transformation. Bereiten Injektion Pads. Geben Sie einen Tropfen von heißem, 2% Agarose in Wasser gelöst, auf ein Deckglas. Schnell stellen ein zweites Deckglas auf dem Tropfen und klopfen es. Nachdem die Agarose erstarrt ist, Dia-Deckgläser auseinander, und backen das Deckglas-Pad in einem Vakuumofen bei 80 ° CO / N. Ziehen Pipetten. Wir verwenden eine Sutter P-97 Abzieher 1/0.5 mm OD / ID Borosilikatglas Kapillaren mit Faden ziehen. Pipetten mit geschlossen…

Representative Results

Mit unserem Protokolle untersuchen wir die Auswirkungen der menschlichen Aß 42 Oligomer auf die neuronale Funktion 8. Ein Fragment, das menschliche Aß 42 und der künstlichen Signalpeptid kodierende Sequenz von Feuer Vektor pPD50.52 Konstrukt wurde aus PCL12 9 unter Verwendung der Primer, die eine Sma 1 Restriktionsendonukleasestelle an den Enden eingeführt. Das Fragment wurde dann in einem Konstrukt, das ein 2.481 bp FLP-6-Promotor-Sequenz in den Vektor pPD95.75 F…

Discussion

Hier beschreiben wir einen kombinierten Ansatz, um zelluläre und molekulare Aspekte der amylopathies mit C. studieren elegans. Die Vorteile dieses Ansatzes sind:. 1) niedrige Kosten C.elegans im normalen Petrischale mit Bakterien geimpft gehalten, bei Raumtemperatur. 2) Leistungsstarke Genetik. Transgene Tiere können in wenigen Monaten erreicht werden und eine Vielzahl von Promotorsequenzen ist, um die Expression des gewünschten Gens in spezifischen Neuronen fahren. 3) Einfach, gut charakte…

Materials

Name of Reagent	Company	Catalog Number	Comments
			1. NGM
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S5886	3 g
Bacteriological agar	AMRESCO	J637	17 g
Bacto-peptone	AMRESCO	J636	2.5 g
Distilled Water			Bring to 975 ml
			Sterilized by autoclaving, then add the following items and mix well
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M2643	1 ml of 1 M stock
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C5670	1 ml of 1 M stock
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C3045	1 ml of 5 mg/ml stock( in ethanol)
Potassium phosphate buffer			25 ml of 1M stock
			2. Potassium phosphate buffer
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655	108.3 g
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	P3786	35.6 g
Distilled Water			Bring to 1 L
			Sterilized by autoclaving
			3. M9 buffer
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655	3 g
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S5136	6 g
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S5886	5 g
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M2643	1 ml of 1 M stock
Distilled Water			Bring to 1 L
			Sterilized by autoclaving
			4. Egg buffer (pH 7.3, 340 mOsm)
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S5886	118 mM
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P5405	48 mM
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C5670	2 mM
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M4880	2 mM
HEPES	Fisher Scientific	BP310	25 mM
Distilled Water			Bring to 1 L
			Sterilized by autoclaving
			5. CM-15
L-15 culture medium	Gibco	11415	450 ml
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437-028	50 ml
Penicillin	Gibco	15140	50 units/ml
Streptomycin	Gibco	15140	50 g/ml
			Adjust to 340 mOsm with sucrose then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C
			6. Other Reagents
Halocarbon 700 oil	Halocarbon Products	9002-83-9
5 μm Acrodisc Syringe Filter	PALL Co.	4199
Chitinase	Sigma-Aldrich	C6137-5UN
Lectin (peanut)	Sigma-Aldrich	L0881-10MG
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	S320
Lysine	Sigma-Aldrich	L5501
Biotin	Sigma-Aldrich	B4639
Sodium hypochlorite solution	Sigma-Aldrich	425044
Sodium azide	Sigma-Aldrich	71289
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389