A Caenorhabditis elegans Sistema Modelo para Estudo Amylopathy

Summary

Nós descrevemos métodos para estudar aspectos da amylopathies do verme C. elegans. Mostramos como construir vermes expressando ABeta humano ₄₂ Em neurônios e como testar sua função em ensaios comportamentais. Temos ainda mostram como obter culturas neuronais primárias que podem ser utilizadas para testes farmacológicos.

Abstract

Amylopathy é um termo que descreve a síntese e a acumulação anormal de beta-amilóide (Ap) em tecidos com o tempo. Ab é uma característica da doença de Alzheimer (AD) e é encontrado na demência com corpos de Lewy, a inclusão miosite corpo e angiopatia amilóide cerebral ^1-4. Amylopathies desenvolver progressivamente com o tempo. Por esta razão, os organismos simples com tempos de vida curtos podem ajudar a elucidar os aspectos moleculares destas condições. Aqui, descrevemos os protocolos experimentais para estudar a neurodegeneração Aâ mediada através do verme Caenorhabditis elegans. Assim, construímos vermes transgênicos, injetando DNA humano codificação ABeta ₄₂ para as gônadas de hermafroditas sincicial adultos. Linhas de transformantes são estabilizados por uma integração induzida por mutagénese. Nemátodes são sincronizados idade recolhendo e semeando os seus ovos. A função de neurónios que expressam Ap ₄₂ é testada em ensaios comportamentais oportunos (ensaio de quimiotaxias). Culturas neuronais primárias obtidas a partir de embriões são usados ​​para complementar os dados de comportamento e para testar os efeitos neuroprotectores dos compostos anti-apoptóticos.

Introduction

Beta amilóide (Ap) é um péptido de 36-43 aminoácidos que é formada após a clivagem sequencial da proteína precursora de amilóide (APP) por β e γ secretases ^1. A secretase γ processa a extremidade C-terminal do péptido Aíi e é responsável pelos seus comprimentos variáveis ^​​5. As formas mais comuns de Ap são Ap ₄₀ e Ap _42, sendo o último mais comum associado a condições patológicas tais como a AD ^5. Em altas concentrações ABeta forma β-folhas que agregam para formar fibrilas amilóides ^6. Depósitos de fibrilas são o principal componente das placas senis que cercam os neurônios. Ambas as placas e....

Protocol

1. Construção de Worms transgênicos

1. Transformação.
   1. Prepare pastilhas de injeção. Colocar uma gota de água quente, de agarose 2% dissolvido em água, sobre uma lamela de vidro. Colocar rapidamente de uma segunda lamela sobre a queda e leve toque nele. Após a agarose é solidificado, lamelas deslizantes afastados, e cozer a lamela direccional num forno de vácuo a 80 ° CO / N.
   2. Puxe pipetas. Nós usamos um Sutter P-97 extrator para puxar 1/0.5 mm OD / ID borosilicato capilares com filamento. As pipetas são fundidas com a ponta fechada, que está quebrado aberto numa fase posterior.
   3. Prepare mix de injeção. Adicione a mistura de injecção....

Results

Com os nossos protocolos nós estudamos os efeitos do humano ABeta ₄₂ oligômero na função neuronal ^8. Um fragmento de codificação ABeta humano ₄₂ eo sinal peptídeo sequência codificante artificial de Fogo vetor pPD50.52 foi amplificado a partir construção PCL12 ⁹ usando primers que introduziram um Sma uma restrição local endonuclease nas extremidades. O fragmento foi então inserido em uma construção contendo um flp-6 sequência do promotor 2481 pb no vector pPD95.75 fog.......

Discussion

Aqui nós descrevemos uma abordagem combinada, para estudar aspectos celulares e moleculares da amylopathies usando C. elegans. As vantagens dessa abordagem incluem: 1.) De baixo custo C.elegans é mantido no prato normal de Petri semeadas com bactérias, à temperatura ambiente. 2) genética poderosas. Os animais transgénicos podem ser obtidos em alguns meses, e uma grande variedade de sequências de promotor está disponível para conduzir a expressão do gene desejado em neurónios específicos. 3) bem caracte.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. NGM
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S5886	3 g
Ágar bacteriológico	AMRESCO	J637	17 g
Bactopeptona	AMRESCO	J636	2,5 g
Água			Leve a 975 ml
Esterilizado em autoclavagem, adicione os seguintes itens e misture bem
Sulfato	de magnésioSigma-Aldrich	M2643	1 ml de estoque 1 M
Cloreto	de cálcio Sigma-Aldrich	C5670	1 ml de estoque 1
M Colesterol	Sigma-Aldrich	C3045	1 ml de estoque de 5 mg / ml (em etanol)
Tampão			de potássio 25 ml de estoque 1M
Fosfato de potássio monobásico	Sigma-Aldrich	P5655	108,3 g
Fosfato de potássio dibásico	Sigma-Aldrich	P3786	35,6 g
Água			Leve a 1 L
Esterilizado em autoclavagem
3. Tampão M9
Fosfato de potássio monobásico	Sigma-Aldrich	P5655	3 g
Fosfato de sódio dibásico	Sigma-Aldrich	S5136	6 g
Cloreto de sódio	Sigma-Aldrich	S5886	5 g
Sulfato de magnésio	Sigma-Aldrich	M2643	1 ml de caldo 1 M Água
destilada			Leve para 1 L
Esterilizado por autoclavagem
4. Tampão de ovo (pH 7,3, 340 mOsm)
Cloreto de Sódio	Sigma-Aldrich	S5886	118 mM
Cloreto	de Potássio Sigma-Aldrich	P5405	48 mM
Cloreto de Cálcio	Sigma-Aldrich	C5670	2 mM
Cloreto de Magnésio	Sigma-Aldrich	M4880	2 mM
HEPES	Fisher Scientific	BP310	25 mM
		destilada	Traga para 1 L
Esterilizado por autoclavagem
5. CM-15
L-15 meio de cultura	Gibco	11415	450 ml
Soro Bovino Fetal	Gibco	10437-028	50 ml
Penicilina	Gibco	15140	50 unidades/ml
Estreptomicina	Gibco	15140	50 g/ml<
6. Outros Reagentes
Halocarbon 700 óleo	Halocarbon Products	9002-83-9
5 μ m Filtro de seringa Acrodisc	PALL Co.	4199
Quitinase	Sigma-Aldrich	C6137-5UN
Lectina (amendoim)	Hidróxido de sódio Sigma-Aldrich	L0881-10MG
	Fisher Scientific	S320
Lisina	Sigma-Aldrich	L5501
Biotina	Sigma-Aldrich	B4639
Solução	de hipoclorito de sódioSigma-Aldrich	425044
azida sódica	Sigma-Aldrich	71289
Sacarose	Sigma-Aldrich	S0389