<em> Caenorhabditis Элеганс</em> Модельной системы для исследования Amylopathy
Summary
Мы опишем методы для изучения аспектов amylopathies в червя<em> C. Элеганс</em>. Мы покажем, как построить червей, экспрессирующих человеческий Ар<sub> 42</sub> В нейронах и как проверить их функции в поведенческих тестах. Далее показано, как получить первичных нейронов культур, которые могут быть использованы для фармакологических испытаний.
Abstract
Amylopathy это термин, который характеризует ненормальное синтез и накопление бета-амилоида (Ар) в тканях со временем. Ар является отличительной чертой болезни Альцгеймера (БА) и находится в деменцию с тельцами Леви, миозит включения тела и церебральной амилоидной ангиопатии 1-4. Amylopathies постепенно развиваются с течением времени. По этой причине простые организмы с короткой продолжительностью жизни может помочь выяснить молекулярные аспекты этих условий. Здесь мы описываем экспериментальных протоколов для изучения Ар-опосредованной нейродегенерацию помощью червя Caenorhabditis Элеганс. Таким образом, мы построим трансгенных червей путем инъекции ДНК, кодирующей человеческий Ар 42 в синцитиальный гонад взрослых гермафродитов. Трансформированных линий стабилизируются индуцированного мутагенеза интеграции. Нематоды возраста синхронизированы путем сбора и посева их яйца. Функции нейронов выражения Ар 42 испытывается в подходящее поведенческого анализа (хемотаксисас). Первичных нейронов культур, полученных из эмбрионов, которые используются для дополнения и поведенческие данные для проверки нейропротекторное действие антиапоптотических соединений.
Introduction
Амилоида бета (Ар) представляет собой пептид из 36-43 аминокислот, которая образуется после последовательного расщепления белка-предшественника амилоида (APP) по β и γ секретазы 1. Γ секретазы обрабатывает C-конца пептида и отвечает за его переменной длины 5. Наиболее распространенными формами являются Ар Ар Ар 40 и 42, причем последний чаще ассоциируется к патологическим состояниям, таким как рекламы 5. При высоких концентрациях Ар форме β-листов для агрегации с образованием амилоидных фибрилл 6. Фибриллы депозиты являются основным компонентом старческих бляшек окружающих нейронов. Оба бляшек и диффузии, не доска олигомеров Ар, как полагают, являются основными формами патогенных Ар.
Лаборатория исследования нейронной amylopathies осложняется тем фактом, что эти условия прогресса с течением времени. Поэтому важнымиT развиваться генетически послушный животных моделях, комплементарные к мышам-с коротким сроком службы. Эти модели могут быть использованы для выяснения конкретных аспектов обычно amylopathies-клеточном и молекулярном и в силу своей простоты, помогают уловить суть проблемы. Червь Caenorhabditis Элеганс водопада эту категорию. Он имеет короткий срок службы, ~ 20 дней, а в дополнение основных клеточных процессах, включая регуляцию экспрессии генов, белков торговли, нейронные связи, синаптогенезе, клеточной сигнализации и смерти подобны млекопитающих 7. Уникальные особенности червя включают в себя мощные генетика и отсутствие сосудистой системы, которая дает возможность изучить повреждения нейронов независимо от сосудистых повреждений. С другой стороны, отсутствие мозга ограничивает применение С. Элеганс к изучению многих аспектов нейродегенерацию. Кроме того, воспроизведение и идентификации анатомических распределения повреждений не может быть выполнена в этом организме. Другой пределобъема отнести сложность для оценки как различия в профили экспрессии генов и обесценения сложное поведение и функции памяти. Здесь мы опишем методы генерирования C. Элеганс моделей amylopathies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы опишем комбинированный подход, изучать клеточные и молекулярные аспекты amylopathies использованием C. Элеганс. Преимущества этого подхода включают: 1.) Низкая стоимость C.elegans поддерживается в нормальном чашку Петри засевают бактерии, при комнатной температуре. 2) Мощный ге…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. NGM | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 3 g |
| Bacteriological agar | AMRESCO | J637 | 17 g |
| Bacto-peptone | AMRESCO | J636 | 2.5 g |
| Distilled Water | Bring to 975 ml | ||
| Sterilized by autoclaving, then add the following items and mix well | |||
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | 1 ml of 1 M stock |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | 1 ml of 1 M stock |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C3045 | 1 ml of 5 mg/ml stock( in ethanol) |
| Potassium phosphate buffer | 25 ml of 1M stock | ||
| 2. Potassium phosphate buffer | |||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | 108.3 g |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | 35.6 g |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 3. M9 buffer | |||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | 3 g |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | 6 g |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 5 g |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | 1 ml of 1 M stock |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 4. Egg buffer (pH 7.3, 340 mOsm) | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 118 mM |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | 48 mM |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | 2 mM |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | 2 mM |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | 25 mM |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 5. CM-15 | |||
| L-15 culture medium | Gibco | 11415 | 450 ml |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | 50 ml |
| Penicillin | Gibco | 15140 | 50 units/ml |
| Streptomycin | Gibco | 15140 | 50 g/ml |
| Adjust to 340 mOsm with sucrose then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C | |||
| 6. Other Reagents | |||
| Halocarbon 700 oil | Halocarbon Products | 9002-83-9 | |
| 5 μm Acrodisc Syringe Filter | PALL Co. | 4199 | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-5UN | |
| Lectin (peanut) | Sigma-Aldrich | L0881-10MG | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S320 | |
| Lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 71289 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 |
Referências
- Hardy, J., Allsop, D. Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer’s disease. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).
- Kotzbauer, P. T., Trojanowsk, J. Q., Lee, V. M. Lewy body pathology in Alzheimer’s disease. Journal of Molecular Neuroscience. 17 (2), 225-232 (2001).
- Greenberg, S. A. Inclusion body myositis: review of recent literature. Current Neurology and Neuroscience Reports. 9 (1), 83-89 (2009).
- Revesz, T., et al. Sporadic and familial cerebral amyloid angiopathies. Brain Pathology. 12 (3), 343-357 (2002).
- Hartmann, T., et al. Distinct sites of intracellular production for Alzheimer’s disease A beta40/42 amyloid peptides. Nature Medicine. 3 (9), 1016-1020 (1997).
- Ohnishi, S., Takano, K. Amyloid fibrils from the viewpoint of protein folding. Cellular and Molecular Life sciences: CMLS. 61 (5), 511-524 (2004).
- DL, R. i. d. d. l. e., et al. C. elegans II. Cold Spring Harbor Monograph. 1, 1222 (1997).
- Cotella, D., et al. Toxic role of k+ channel oxidation in Mammalian brain. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (12), 4133-4144 (2012).
- Link, C. D. Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9368-9372 (1995).
- Cai, S. Q., Sesti, F. Oxidation of a potassium channel causes progressive sensory function loss during aging. Nature Neuroscience. 12 (5), 611-617 (2009).
- Yu, S., et al. Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 3384-3387 (1997).
- Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans. Neuron. 7 (5), 729-742 (1991).
- Caserta, T. M., et al. Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties. Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 8 (4), 345-352 (2003).
- Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33 (4), 503-514 (2002).
