Rekonstituering af et Kv Channel i lipidmembraner for strukturelle og funktionelle studier
Summary
Procedurer for rekonstituering af en prototype spændingsstyret kaliumkanal i lipidmembraner beskrevet. De rekonstituerede kanaler er egnet til biokemiske analyser, elektriske optagelser, ligand screening og elektron krystallografiske studier. Disse metoder kan have generelle anvendelser til de strukturelle og funktionelle studier af andre membranproteiner.
Abstract
At undersøge lipid-protein-interaktion i en reduktionistisk måde, er det nødvendigt at inkorporere membranproteiner i membraner af veldefineret lipidsammensætning. Vi studerer lipid-afhængige gating effekter i en prototype spændingsstyret kalium (Kv) kanal og har arbejdet detaljerede procedurer at rekonstruere kanalerne i forskellige membran-systemer. Vores rekonstituering procedurer tager hensyn til både vaskemiddel-induceret fusion af vesikler og sammensmeltningen af protein / detergent miceller med lipid / detergent blandede miceller samt betydningen af at nå en ligevægt fordeling af lipider blandt protein / detergent / lipid og detergent / lipid blandede miceller. Vores data antydede, at indsættelsen af kanalerne i lipidvesiklerne er forholdsvis tilfældigt i orienteringer, og rekonstituering effektivitet er så høj, at ingen påviselige protein aggregater blev set i fraktionering eksperimenter. Vi har udnyttet rekonstituered kanaler til at bestemme de konformationelle tilstande af kanalerne i forskellige lipider, registrerer elektriske aktiviteter af et lille antal kanaler er indarbejdet i plane lipiddobbeltlag, skærm til kropsbygning-specifikke ligander fra en fag-viste peptid bibliotek og støtte væksten i 2D krystaller af kanalerne i membranerne. Rekonstitueringen her beskrevne procedurer kan tilpasses til at studere andre membranproteiner i lipiddobbeltlag, især til undersøgelse af lipid effekter på eukaryote spændingsstyrede ionkanaler.
Introduction
Celler udveksle materialer og information med deres omgivelser gennem funktionerne af specifikke membranproteiner 1.. Membranproteiner i cellemembraner fungerer som pumper, kanaler, receptorer, intramembrane enzymer, linkere og strukturelle støtter tværs membraner. Mutationer, der påvirker membranproteiner har været relateret til mange humane sygdomme. Faktisk har mange membranproteiner været de primære lægemiddelkandidater, fordi de er vigtige og let tilgængelige i cellemembraner. Det er derfor meget vigtigt at forstå strukturen og funktionen af forskellige membranproteiner i membraner, og gøre det muligt at udforme nye metoder til at afhjælpe de skadelige virkninger fra de mutante proteiner i humane sygdomme.
Lipider omgiver alle membranproteiner integreret i dobbeltlag 2, 3. I eukaryote membraner, er de forskellige typer af lipider kendt for at være organiseret i mikrodomæner 4, 5.Mange membranproteiner viste sig at være fordelt blandt disse mikrodomæner samt voluminøse flydende fase af membraner 3, 6. Mekanismen bag organiseringen af mikrodomæner og levering af membranproteiner ind i dem, og den fysiologiske betydning af sådanne distributioner er helt klart vigtigt, men forbliver dårligt forstået. En større tekniske vanskeligheder i at studere lipid effekter på membranproteiner er pålidelig rekonstituering af biokemisk oprensede membranproteiner i membraner af velkontrollerede lipid sammensætning, således at næsten alle rekonstitueres proteiner er funktionelle 7.. I de sidste par år har vi udviklet metoder til at rekonstruere prototype spændingsstyret kaliumkanal fra A. pernix (KvAP) i forskellige membran systemer til strukturelle og funktionelle studier 8-10. Dataene fra andre og os sammen viste, at lipiderne er sandsynligvis en bestemmende faktor i konformationelle ændringer i spænding-sensingdomæner af en spænding ionkanal og kan forme strukturerne af nogle af disse kanaler 11. I den næste, vil vi give en detaljeret beskrivelse af vores metoder og vil tilbyde kritiske tekniske tips, der vil sandsynligvis sikre en vellykket reproduktion af vores resultater samt en udvidelse af vores metoder til studier af andre membranproteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rekonstituering af KvAP kanaler i forskellige membraner har været anvendt i flere undersøgelser 8-10. Efter ideen om at sikre fordelingen af lipider mellem vaske / lipid blandede miceller og protein / detergent / lipid blandede miceller, er vi i stand til at nå op på næsten fuldstændig opløst KvAP i membraner lavet af meget forskellige lipider. Hver tetramere KvAP kanal behov ~ 100 lipid molekyler til fuldt ud at dække sit transmembrane domæne. Det væsentlige krav er at tillade nok lipidmoleky…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Undersøgelserne vedrørende KvAP i Jiang lab har fået betydelig hjælp fra Dr. Roderick MacKinnon laboratorium på Rockefeller University. En særlig tak til Dr. Kathlynn Brown og Michael McQuire for deres råd og hjælp på vores fag-screen eksperimenter. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra NIH (GM088745 og GM093271 til Q-XJ) og AHA (12IRG9400019 til Q-XJ).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | RPI Corp. | T60060 | |
| Yeast Extract | RPI Corp. | Y20020 | |
| NaCl | Fisher | S271-3 | |
| Tris Base | RPI Corp. | T60040 | |
| Potassium Chloride | Fisher | BP366-500 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltoside | Affymetrix | D322S | Sol-grade |
| n-Octyl-β-D-Glucoside | Affymetrix | O311 | Ana-grade |
| Aprotinin | RPI Corp. | A20550-0.05 | |
| Leupeptin | RPI Corp. | L22035-0.025 | |
| Pepstatin A | RPI Corp. | P30100-0.025 | |
| PMSF | SIGMA | P7626 | |
| Dnase I | Roche | 13407000 | |
| Bio-Bead SM-2 | Bio-Rad | 152-3920 | |
| HEPES | RPI Corp. | H75030 | |
| POPE | Avanti Polar Lipids | 850757C | |
| POPG | Avanti Polar Lipids | 840457C | |
| DOGS | Avanti Polar Lipids | 870314C | |
| DMPC | Avanti Polar Lipids | 850345C | |
| Biotin-DOPE | Avanti Polar Lipids | 870282C | |
| DOTAP | Avanti Polar Lipids | 890890C | |
| NeutrAvidin agarose beads | Piercenet | 29200 | |
| Dialysis Tubing | Spectrum Laboratories, Inc | 132-570 | |
| Pentane | Fisher | R399-1 | |
| Decane | TCI America | D0011 | |
| MTS-PEG5000 | Toronto Research Cemicals | M266501 |
Referências
- Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. , (2007).
- Lee, A. G. How lipids and proteins interact in a membrane: a molecular approach. Mol. Biosyst. 1, 203 (2005).
- Lee, A. G. How lipids affect the activities of integral membrane proteins. Biochim. Biophys. Acta. 1666, 62 (2004).
- Anderson, R. G. The caveolae membrane system. Annu. Rev. Biochem. 67, 199 (1998).
- Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 269 (2004).
- Edidin, M. The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 257 (2003).
- Kapoor, R., Kim, J. H., Ingolfson, H., Andersen, O. S. Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments. J. Vis. Exp. (20), e1033 (2008).
- Zheng, H., Liu, W., Anderson, L. Y., Jiang, Q. X. Lipid-dependent gating of a voltage-gated potassium channel. Nat. Commun. 2, 250 (2011).
- Schmidt, D., Jiang, Q. X., MacKinnon, R. Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors. Nature. 444, 775 (2006).
- Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422, 180 (2003).
- Jiang, Q. X., Gonen, T. The influence of lipids on voltage-gated ion channels. Curr. Opin. Struct. Biol. , 3408884 (2012).
- Artimo, P., et al. ExPASy: SIB bioinformatics resource portal. Nucleic Acids Res. 40, W597 (2012).
- Cladera, J., Rigaud, J. L., Villaverde, J., Dunach, M. Liposome solubilization and membrane protein reconstitution using Chaps and Chapso. Eur. J. Biochem. 243, 798 (1997).
- Levy, D., Bluzat, A., Seigneuret, M., Rigaud, J. L. A systematic study of liposome and proteoliposome reconstitution involving Bio-Bead-mediated Triton X-100 removal. Biochim. Biophys. Acta. 1025, 179 (1990).
- Young, H. S., Rigaud, J. L., Lacapere, J. J., Reddy, L. G., Stokes, D. L. How to make tubular crystals by reconstitution of detergent-solubilized Ca2(+)-ATPase. Biophys. J. 72, 2545 (1997).
- Levy, D., Gulik, A., Bluzat, A., Rigaud, J. L. Reconstitution of the sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-ATPase: mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. Biochim. Biophys. Acta. 1107, 283 (1992).
- Cohen, F. S., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. Fusion of phospholipid vesicles with planar phospholipid bilayer membranes. II. Incorporation of a vesicular membrane marker into the planar membrane. The Journal of General Physiology. 75, 251 (1980).
- Fuks, B., Homble, F. Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids. Biophysical Journal. 66, 1404 (1994).
- Hanke, W., Schlue, W. -. R., Sattelle, D. B. Planar Lipid Bilayers. Methods and Applications. Biological Techniques. , 133 (1993).
- Tien, H. T. . Bilayer lipid membranes (BLM). Theory and Practice. , 655-65 (1974).
- Pagano, R. E., Ruysschaert, J. M., Miller, I. R. The molecular composition of some lipid bilayer membranes in aqueous solution. The Journal of Membrane Biology. 10, 11 (1972).
- Henn, F. A., Thompson, T. E. Properties of lipid bilayer membranes separating two aqueous phases: composition studies. Journal of Molecular Biology. 31, 227 (1968).
- Tao, X., MacKinnon, R. Functional analysis of Kv1.2 and paddle chimera Kv channels in planar lipid bilayers. J. Mol. Biol. 382, 24 (2008).
- Cohen, F. S., Akabas, M. H., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. Parameters affecting the fusion of unilamellar phospholipid vesicles with planar bilayer membranes. The Journal of Cell Biology. 98, 1054 (1984).
- Smith, G. P., Petrenko, V. A. Phage Display. Chem. Rev. 97, 391-39 (1997).
- McGuire, M. J., Li, S., Brown, K. C. Biopanning of phage displayed peptide libraries for the isolation of cell-specific ligands. Methods Mol. Biol. 504, 291 (2009).
- Rigaud, J. L. Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals. Braz. J. Med. Biol. Res. 35, 753 (2002).
- Chami, M., et al. Use of octyl beta-thioglucopyranoside in two-dimensional crystallization of membrane proteins. J. Struct. Biol. 133, 64 (2001).
- Kuhlbrandt, W. Two-dimensional crystallization of membrane proteins. Q. Rev. Biophys. 25, 1 (1992).
- Rigaud, J. L., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65 (2003).
- Walz, T., Grigorieff, N. Electron Crystallography of Two-Dimensional Crystals of Membrane Proteins. J. Struct. Biol. 121 (2), 142 (1998).
- Signorell, G. A., Kaufmann, T. C., Kukulski, W., Engel, A., Remigy, H. W. Controlled 2D crystallization of membrane proteins using methyl-beta-cyclodextrin. J. Struct. Biol. 157, 321 (2007).
- Vink, M., Derr, K., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins. J. Struct. Biol. 160, 295 (2007).
- Iacovache, I., et al. The 2DX robot: a membrane protein 2D crystallization Swiss Army knife. J. Struct. Biol. 169, 370 (2010).
