संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययन के लिए लिपिड झिल्ली में एक केवी चैनल का पुनर्गठन
Summary
लिपिड झिल्ली में एक प्रोटोटाइप वोल्टेज gated पोटेशियम चैनल की पूरी पुनर्गठन के लिए प्रक्रिया वर्णित हैं. पुनर्गठन चैनलों जैव रासायनिक assays, बिजली रिकॉर्डिंग, ligand के स्क्रीनिंग और इलेक्ट्रॉन crystallographic पढ़ाई के लिए उपयुक्त हैं. इन विधियों अन्य झिल्ली प्रोटीन के संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययन करने के लिए सामान्य आवेदन कर सकते हैं.
Abstract
एक reductionistic फैशन में लिपिड, प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए, यह अच्छी तरह से परिभाषित लिपिड रचना की झिल्ली में झिल्ली प्रोटीन को शामिल करने के लिए आवश्यक है. हम एक प्रोटोटाइप वोल्टेज gated पोटेशियम (केवी) चैनल में लिपिड निर्भर gating के प्रभावों का अध्ययन कर रहे हैं, और विभिन्न झिल्ली सिस्टम में पुनर्गठित चैनलों के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं बाहर काम किया है. हमारी पुनर्गठन प्रक्रियाओं डिटर्जेंट प्रेरित पुटिका के विलय और प्रोटीन / डिटर्जेंट लिपिड / डिटर्जेंट मिश्रित मिसेलस साथ मिसेलस के साथ ही प्रोटीन / डिटर्जेंट / लिपिड और डिटर्जेंट में लिपिड का एक संतुलन वितरण तक पहुँचने के महत्व के विलय दोनों का ध्यान रखना / लिपिड मिश्रित मिसेलस. हमारे डेटा लिपिड vesicles में चैनलों की प्रविष्टि झुकाव में अपेक्षाकृत यादृच्छिक सुझाव दिया है कि, और पुनर्गठन दक्षता कोई detectable प्रोटीन समुच्चय fractionation के प्रयोगों में देखा गया है कि इतनी अधिक है. हम पुनर्गठन का उपयोग किया हैअलग लिपिड में चैनलों के गठनात्मक राज्यों निर्धारित करने के लिए घ चैनलों, तलीय लिपिड bilayers में शामिल चैनलों की एक छोटी संख्या, एक फेज प्रदर्शित पेप्टाइड पुस्तकालय से रचना विशिष्ट ligands के लिए स्क्रीन के बिजली गतिविधियों को रिकॉर्ड, और 2 डी क्रिस्टल के विकास का समर्थन झिल्ली में चैनलों की. यहाँ वर्णित पुनर्गठन प्रक्रियाओं खासकर यूकेरियोटिक वोल्टेज gated आयन चैनल पर लिपिड प्रभाव की जांच के लिए, लिपिड bilayers में अन्य झिल्ली प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
Introduction
प्रकोष्ठों विनिमय सामग्री और विशिष्ट झिल्ली प्रोटीन 1 के कार्यों के माध्यम से अपने पर्यावरण के साथ जानकारी. कोशिका झिल्ली में झिल्ली प्रोटीन पंप, चैनल, रिसेप्टर्स, intramembrane एंजाइमों, linkers और झिल्ली में संरचनात्मक समर्थकों के रूप में कार्य करते हैं. झिल्ली प्रोटीन प्रभावित म्यूटेशनों कि कई मानव रोगों से संबंधित कर दिया गया है. वे महत्वपूर्ण और कोशिका झिल्लियों में आसानी से उपलब्ध हैं क्योंकि वास्तव में, कई झिल्ली प्रोटीन प्राथमिक दवा लक्ष्य दिया गया है. यह झिल्ली में विभिन्न झिल्ली प्रोटीन की संरचना और समारोह को समझते हैं, और यह संभव मानव रोगों में उत्परिवर्ती प्रोटीन से हानिकारक प्रभाव को कम करने के तरीकों उपन्यास वसीयत करने के लिए बनाने के लिए इसलिए बहुत महत्वपूर्ण है.
लिपिड bilayers 2, 3 में एकीकृत सभी झिल्ली प्रोटीन के चारों ओर. यूकेरियोटिक झिल्ली में, लिपिड के विभिन्न विभिन्न प्रकार microdomains 4, 5 में संगठित होने के लिए जाना जाता है.कई झिल्ली प्रोटीन इन microdomains के साथ ही झिल्ली 3, 6 की भारी तरल पदार्थ चरण के बीच वितरित किया जाना दिखाया गया. microdomains और झिल्ली प्रोटीन का वितरण उन में और इस तरह के वितरण के शारीरिक महत्व के संगठन अंतर्निहित तंत्र स्पष्ट रूप से महत्वपूर्ण हैं, लेकिन खराब समझ रहते हैं. झिल्ली प्रोटीन पर लिपिड प्रभाव का अध्ययन करने में एक प्रमुख तकनीकी कठिनाई लगभग सभी पुनर्गठन प्रोटीन कार्यात्मक 7 रहे हैं कि इतना biochemically अच्छी तरह से नियंत्रित लिपिड रचना की झिल्ली में झिल्ली प्रोटीन शुद्ध विश्वसनीय पुनर्गठन है. पिछले कुछ वर्षों में, हम पुनर्गठित करने के लिए ए से प्रोटोटाइप वोल्टेज gated पोटेशियम चैनल तरीके विकसित संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययन 8-10 के लिए विभिन्न झिल्ली सिस्टम में Pernix (KvAP). दूसरों से डेटा और हमें एक साथ लिपिड संभावना वोल्टेज संवेदन के गठनात्मक परिवर्तन में एक निर्धारक हैं कि पता चलाएक वोल्टेज gated आयन चैनल और के डोमेन इन चैनलों के 11 में से कुछ के ढांचे को आकार कर सकते हैं. अगले में, हम हमारे तरीके का विस्तृत विवरण प्रदान करेगा और संभावना है कि हमारे परिणाम के सफल प्रजनन के साथ ही अन्य झिल्ली प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए हमारे तरीके का विस्तार सुनिश्चित करेंगे कि महत्वपूर्ण तकनीकी सुझावों की पेशकश करेगा.
Protocol
Representative Results
Discussion
अलग झिल्ली में KvAP चैनलों के पुनर्गठन के कई अध्ययनों से 8-10 में इस्तेमाल किया गया है. डिटर्जेंट / लिपिड मिश्रित मिसेलस और प्रोटीन / डिटर्जेंट / लिपिड मिश्रित मिसेलस बीच लिपिड का वितरण सुनिश्चित करने के …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
जियांग प्रयोगशाला में KvAP पर पढ़ाई रॉकफेलर विश्वविद्यालय में डॉ. रॉड्रिक MacKinnon की प्रयोगशाला से महत्वपूर्ण मदद प्राप्त किया है. विशेष धन्यवाद उनकी सलाह के लिए डॉ. Kathlynn ब्राउन और माइकल McQuire जाने के लिए और हमारे फेज स्क्रीन प्रयोगों पर मदद करते हैं. इस काम एनआईएच (क्यू XJ को GM088745 और GM093271) और अहा (क्यू XJ को 12IRG9400019) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | RPI Corp. | T60060 | |
| Yeast Extract | RPI Corp. | Y20020 | |
| NaCl | Fisher | S271-3 | |
| Tris Base | RPI Corp. | T60040 | |
| Potassium Chloride | Fisher | BP366-500 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltoside | Affymetrix | D322S | Sol-grade |
| n-Octyl-β-D-Glucoside | Affymetrix | O311 | Ana-grade |
| Aprotinin | RPI Corp. | A20550-0.05 | |
| Leupeptin | RPI Corp. | L22035-0.025 | |
| Pepstatin A | RPI Corp. | P30100-0.025 | |
| PMSF | SIGMA | P7626 | |
| Dnase I | Roche | 13407000 | |
| Bio-Bead SM-2 | Bio-Rad | 152-3920 | |
| HEPES | RPI Corp. | H75030 | |
| POPE | Avanti Polar Lipids | 850757C | |
| POPG | Avanti Polar Lipids | 840457C | |
| DOGS | Avanti Polar Lipids | 870314C | |
| DMPC | Avanti Polar Lipids | 850345C | |
| Biotin-DOPE | Avanti Polar Lipids | 870282C | |
| DOTAP | Avanti Polar Lipids | 890890C | |
| NeutrAvidin agarose beads | Piercenet | 29200 | |
| Dialysis Tubing | Spectrum Laboratories, Inc | 132-570 | |
| Pentane | Fisher | R399-1 | |
| Decane | TCI America | D0011 | |
| MTS-PEG5000 | Toronto Research Cemicals | M266501 |
Referências
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