La reconstitución de un canal Kv en las membranas lipídicas de Estudios estructurales y funcionales
Summary
Se describen procedimientos para la reconstitución completa de un canal de potasio dependiente de voltaje prototipo en las membranas lipídicas. Los canales reconstituidas son adecuadas para los ensayos bioquímicos, grabaciones eléctricas, detección ligando y estudios de cristalografía de electrones. Estos métodos pueden tener aplicaciones generales a los estudios estructurales y funcionales de otras proteínas de membrana.
Abstract
Para estudiar la interacción lípido-proteína en una manera reduccionista, es necesario incorporar las proteínas de membrana en membranas de composición de lípidos bien definido. Estamos estudiando los efectos de compuerta lípido-dependientes de un canal de potasio dependiente de voltaje prototipo (Kv), y se han elaborado procedimientos detallados para reconstituir los canales en diferentes sistemas de membranas. Nuestros procedimientos de reconstitución toman consideración de tanto la fusión inducida por detergente de las vesículas y la fusión de proteína / detergente con las micelas lípido / detergente micelas mixtas, así como la importancia de alcanzar un equilibrio de distribución de los lípidos entre la proteína / detergente / lípido y el detergente / lípidos micelas mixtas. Nuestros datos sugieren que la inserción de los canales en las vesículas lipídicas es relativamente aleatoria en orientaciones, y la eficacia de reconstitución es tan alta que no hay agregados de proteínas detectables se observaron en experimentos de fraccionamiento. Hemos utilizado el reconstituird canales para determinar los estados conformacionales de los canales en diferentes lípidos, registrar las actividades eléctricas de un pequeño número de canales incorporados en bicapas lipídicas planas, pantalla para ligandos específicos de conformación de una biblioteca de fagos, y apoyar el crecimiento de cristales 2D de los canales en las membranas. Los procedimientos de reconstitución descritos aquí se pueden adaptar para el estudio de otras proteínas de membrana en bicapas lipídicas, especialmente para la investigación de los efectos sobre los lípidos en los canales iónicos dependientes de voltaje eucariotas.
Introduction
Células materiales de intercambio e información con su entorno a través de las funciones de las proteínas de membrana específicos 1. Las proteínas de membrana en membranas celulares funcionan como bombas, canales, receptores, enzimas intramembrane, enlazadores y simpatizantes estructurales a través de membranas. Las mutaciones que afectan a las proteínas de la membrana se han relacionado con muchas enfermedades humanas. De hecho, muchas proteínas de membrana han sido los principales objetivos de drogas porque son importantes y de fácil acceso en las membranas celulares. Por lo tanto, es muy importante para comprender la estructura y la función de varias proteínas de membrana en membranas, y que sea posible diseñar nuevos métodos para aliviar los efectos perjudiciales de las proteínas mutantes en las enfermedades humanas.
Los lípidos rodean todas las proteínas de membrana integradas en bicapas 2, 3. En las membranas eucariotas, son conocidos los diversos tipos diferentes de lípidos a ser organizado en microdominios 4, 5.Muchas proteínas de la membrana se muestran para ser distribuidos entre estos microdominios, así como la fase fluida voluminosos de las membranas 3, 6. El mecanismo subyacente a la organización de los microdominios y la entrega de proteínas de membrana en ellos y la importancia fisiológica de dichas distribuciones son claramente importantes, pero siguen siendo poco conocidos. Una importante dificultad técnica en el estudio de los efectos sobre los lípidos de las proteínas de membrana es la reconstitución fiable purificada bioquímicamente las proteínas de membrana en las membranas de la composición lipídica bien controlados por lo que casi todas las proteínas reconstituidos son funcionales 7. En los últimos años, hemos desarrollado métodos para reconstituir el canal de potasio dependiente de voltaje prototipo de A. pernix (KvAP) en varios sistemas de membrana para estudios estructurales y funcionales 8-10. Los datos de otros y juntos mostraron que los lípidos son probablemente un factor determinante en los cambios conformacionales de la detección de voltajedominios de un canal de iones y de voltaje pueden dar forma a las estructuras de algunos de estos canales 11. En el siguiente, vamos a proporcionar una descripción detallada de los métodos y ofreceremos consejos técnicos críticos que probablemente aseguren el éxito de la reproducción de los resultados, así como la extensión de los métodos para los estudios de otras proteínas de membrana.
Protocol
Representative Results
Discussion
La reconstitución de los canales KvAP en diferentes membranas se ha utilizado en varios estudios 8-10. Siguiendo la idea de asegurar la distribución de los lípidos entre detergentes / lípidos micelas mixtas y las micelas mixtas proteína / detergente / lípidos, que son capaces de llegar a la reconstitución casi completa del KvAP en las membranas hechas de muy diferentes lípidos. Cada canal KvAP tetrameric necesita ~ 100 moléculas de lípidos para cubrir totalmente su dominio transmembrana. El requisit…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los estudios sobre KvAP en el laboratorio de Jiang han obtenido una ayuda importante desde el laboratorio del Dr. Roderick MacKinnon, de la Universidad Rockefeller. Un agradecimiento especial al Dr. Kathlynn Brown y Michael McQuire por sus consejos y ayuda en nuestros experimentos de pantalla fago. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH (GM088745 GM093271 y de Q-XJ) y la AHA (12IRG9400019 a Q-XJ).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | RPI Corp. | T60060 | |
| Yeast Extract | RPI Corp. | Y20020 | |
| NaCl | Fisher | S271-3 | |
| Tris Base | RPI Corp. | T60040 | |
| Potassium Chloride | Fisher | BP366-500 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltoside | Affymetrix | D322S | Sol-grade |
| n-Octyl-β-D-Glucoside | Affymetrix | O311 | Ana-grade |
| Aprotinin | RPI Corp. | A20550-0.05 | |
| Leupeptin | RPI Corp. | L22035-0.025 | |
| Pepstatin A | RPI Corp. | P30100-0.025 | |
| PMSF | SIGMA | P7626 | |
| Dnase I | Roche | 13407000 | |
| Bio-Bead SM-2 | Bio-Rad | 152-3920 | |
| HEPES | RPI Corp. | H75030 | |
| POPE | Avanti Polar Lipids | 850757C | |
| POPG | Avanti Polar Lipids | 840457C | |
| DOGS | Avanti Polar Lipids | 870314C | |
| DMPC | Avanti Polar Lipids | 850345C | |
| Biotin-DOPE | Avanti Polar Lipids | 870282C | |
| DOTAP | Avanti Polar Lipids | 890890C | |
| NeutrAvidin agarose beads | Piercenet | 29200 | |
| Dialysis Tubing | Spectrum Laboratories, Inc | 132-570 | |
| Pentane | Fisher | R399-1 | |
| Decane | TCI America | D0011 | |
| MTS-PEG5000 | Toronto Research Cemicals | M266501 |
Referências
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