FlyBar: מתן אלכוהול לזבובים
Summary
דרוזופילה התפתחה כמערכת מודל משמעותית עבור לנתח את הבסיס התאי ומולקולרית של תגובות התנהגותיות לאלכוהול. כאן אנו מציגים פרוטוקול לאיסוף נתונים רגישות אלכוהול בהקשר היממה שיכולה להיות מיושם בקלות לניסויים אחרים, והוא מתאים היטב למחקר לתואר ראשון.
Abstract
זבובי פירות (דרוזופילה melanogaster) הם מודל שהוקם עבור שני מחקרי אלכוהול וביולוגיה היממה. לאחרונה, הראה כי השעון הביולוגי מווסת את רגישות לאלכוהול, אך לא היווצרות של סובלנות. כאן אנו מתארים הפרוטוקול שלנו בפירוט. אלכוהול ניתן לזבובים באמצעות FlyBar. בהגדרה זו, אדי אלכוהול רוויים הוא מעורבב עם אוויר humidified בפרופורציות קבועות, וניתן לזבובים בארבע שפופרות בו זמנית. זבובים שגודלו בתנאים אחידים כדי למזער וריאציה בין משכפל. זבובים ישנים שלושה ימים של גנוטיפים או טיפולים שונים המשמשים לניסויים, רצוי על ידי זבובים משתי נקודות זמן שונות (למשל, CT 5 ו-CT 17) מה שהופך את השוואה ישירה אפשרית תואם. במהלך הניסוי, זבובים נחשפים לשעה 1 לשיעור שנקבע מראש של אדי אלכוהול ומספר הזבובים שמפגין אובדן ליישר רפלקס (LoRR) או sedation נספרים כל 5 דקות. ניתן לנתח את הנתונים באמצעות שלוש גישות סטטיסטיות שונות. הראשון הוא לקבוע את המועד שבי 50% מהזבובים איבדו את רפלקס ליישרם ולהשתמש בניתוח השונה (ANOVA) כדי לקבוע אם הבדלים משמעותיים קיימים בין נקודות זמן. השני הוא לקבוע את אחוז הזבובים שמראים LoRR לאחר מספר מסוים של דקות, ואחרי ניתוח ANOVA. השיטה האחרונה היא לנתח את סדרת כולה פעמים באמצעות סטטיסטיקה רב משתני. גם הפרוטוקול יכול לשמש לניסויים או השוואות שאינן היממה בין גנוטיפים.
Introduction
תסיסנית להפגין תגובות התנהגותיות biphasic לאלכוהול 1 שהם מקבילים לתגובות אנושיות לתרופה זו 2,3. לאחר החשיפה ראשונית לריכוזים נמוכים של אלכוהול, זבובי פעילות של תנועה מוגברת תערוכה, הוחלף על ידי חוסר הקואורדינציה מוטורית, אובדן השליטה ביציבה ורפלקסים ליישר (אובדן ליישר רפלקס: LoRR), והרגעה (חוסר הפעילות מוטורית בתגובה מלאה לגירוי מכאני) כחשיפה לאלכוהול מתקדמת 4-9. השעון הביולוגי אנדוגני הוא מאפנן חזק של רגישות אלכוהול ורעילות כפי שנצפה בעכברים 10,11, חולדות 12, ובני האדם 13. ההתקדמות שחלה באחרונה במחקר דרוזופילה הראו שעון היממה מודולציה רגישות אלכוהול חריף אך לא אלכוהול סובלנות 1. גישות רבות עוצמה הגנטית הזמינות בדרוזופילה באמצעות מחקרי מוטציה ומניפולציות מהונדסים של המרחביתוביטוי גנים של זמן מספק מערכת המאפשרת התקדמות מהירה בזיהוי המנגנונים התאיים ומולקולריים שבבסיס להתנהגויות מורכבות. השימוש בדרוזופילה ככלי חקירה התירה התקדמות מהותית בהבנת נוירוביולוגיה אלכוהול שיכול להיות מתורגמת במהירות ליונקים 14-16. על מנת להקל על ההבנה של המנגנונים המולקולריים שבאמצעותו השעון הביולוגי מודולציה רגישות אלכוהול ולמדוד באופן אחיד על פני תגובות התנהגותיות נקודות זמן היממה, פרוטוקול ממשל אלכוהול מתאים לשימוש בתנאי אור אדום עמומים נדרש. לדרוזופילה, אלכוהול יכול להינתן באמצעות תוספי מזון לחשיפה כרונית או באופן אמין דרך בניהול אלכוהול בצורה של אדים לחשיפות אקוטיות. כאן אנו מתארים פרוטוקול ממשל אלכוהול מתאים להערכה של אפנון היממה של רפלקס הפסד של ליישר (LoRR) 1, כמו גםתרופות הרגעה.
זבובים נגררו עם שעות 12: 12 מחזורי LD שעות בטמפרטורה קבועה ולאחר מכן הועברו למשטר אור נשלט על 2-5 ימים, תלוי בשאלה הניסיונית. זבובים נחשפים לאדי אתנול במכשיר המכונה FlyBar. במכשיר זה, כמויות מבוקרות של אוויר מבעבעים דרך מים ואלכוהול; לאחר מכן האדים מעורבבים וביימו לדיור בקבוקון הזבובים. כל 5 דקות זבובי כבש עבור המספר שאינו מצליח להציג ליישר רפלקסים או הפכו מסומם. אחוזי LoRR עבור כל נקודת זמן מחושבים והשוואה בין נקודות זמן היממה או בין הזנים של זבובים. הפשטות והאמינות של אספקת אלכוהול באמצעות משלוח אלכוהול FlyBar בשילוב עם אפשרויות ניתוח התנהגות מספקת יתרון משמעותי לניסויים ביולוגיים שנערכו בתנאים חשוכים.
Protocol
Representative Results
Discussion
העלויות של שימוש לרעה באלכוהול ואלכוהוליזם לחברה היא אדירות, הן במונחים של עלויות אנושיות 29 וכלכליות 30,31. דרוזופילה כמודל מציעה מערכת מהירה ותכליתית כדי לבחון במהירות את התגובות התנהגותיות של מספר גדול של אנשים ובתור שכזו כבר נעשה שימוש נרחב עבור שנ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מימון למחקר זה מסופק על ידי תכנית במדעי המוח בפרס ממדינת מכללת פלורידה לרפואה של האוניברסיטה ותמיכה מהמחלקה למדע ביולוגי בברית המועצות לשעבר. מימון נוסף מסופק על ידי גרנט-in-Aid מקרן המחקר של אלכוהול משקאות היצרן.
Materials
| Alcohol 190 proof | Various | ||
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Aerator | Local pet store | We use Whisper 60 | |
| Silicone tubing 1/8” | VWR | 408060-0030 | |
| 120° Y Connector | VWR | 82017-256 | |
| Quick disconnects | VWR | 46600-048 | |
| Plastic tube clamps | Bell-art products | 132250000 | Either this or next |
| Miniature Air Regulator | McMaster-Carr | 8727K11 | Either this or previous |
| Miniature Air Regulator Mounting Bracket | McMaster-Carr | 9891K66 | |
| Gilmont size 12 flow meter | VWR | 29895-242 | |
| Tool clips | McMaster-Carr | 1722A43 | To hold flow meters |
| Vial | VWR | 89092-722 | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59585-186 | Fits in vials |
| 5 mm Pyrex Glass tubes | Trikinetics | PGT5x65 | Fits best in previous stopper. |
| Teflon tape | Hardware store | To achieve snug fit in stoppers if necessary | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59582-122 | Fits our bottles |
| Disposable glass pipets | VWR | 53283-768 | Cut to length and bend by heating |
| Very fine nylon netting | VWR | Various | |
| 15 watt bulbs | Hardware store | Overhead red light | |
| Photographic red safe light filters | Overhead red light | ||
| Mini Flashlights with red filters | Mag-light |
Referências
- Linde, K., Lyons, L. C. Circadian modulation of acute alcohol sensitivity but not acute tolerance in Drosophila. Chronobiol. Int. 28, 397-406 (2011).
- Kaun, K. R., Azanchi, R., Maung, Z., Hirsh, J., Heberlein, U. A Drosophila model for alcohol reward. Nat Neurosci. 14, 612-619 (2011).
- Shohat-Ophir, G., Kaun, K. R., Azanchi, R., Mohammed, H., Heberlein, U. Sexual deprivation increases ethanol intake in Drosophila. Science. 335, 1351-1355 (2012).
- Bellen, H. J. The fruit fly: A model organism to study the genetics of alcohol abuse and addiction. Cell. 93, 909-912 (1998).
- Guarnieri, D. J., Heberlein, U. Drosophila melanogaster, a genetic model system for alcohol research. International Review of Neurobiology. 54, 203-232 (2003).
- Scholz, H. Intoxicated fly brains: Neurons mediating ethanol-induced behaviors. J. Neurogenet. 23, 111-119 (2009).
- Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T. Y., Heberlein, U. High-resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila. J. Neurosci. 22, 11035-11044 (2002).
- Schumann, G., Spanagel, R., Mann, K. Candidate genes for alcohol dependence: Animal studies. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 27, 880-888 (2003).
- Singh, C. M., Heberlein, U. Genetic control of acute ethanol-induced behaviors in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 24, 1127-1136 (2000).
- Perreau-Lenz, S., Zghoul, T., de Fonseca, F. R., Spanagel, R., Bilbao, A. Circadian regulation of central ethanol sensitivity by the mPer2 gene. Addiction Biology. 14, 253-259 (2009).
- Brager, A. J., Prosser, R. A., Glass, J. D. Circadian and acamprosate modulation of elevated ethanol drinking in mPer2 clock gene mutant mice. Chronobiol. Int. 28, 664-672 (2011).
- Sinclair, J. D., Geller, I. Ethanol consumption by rats under different lighting conditions. Science. 175, 1143-1144 (1972).
- Danel, T., Jeanson, R., Touitou, Y. Temporal pattern in consumption of the first drink of the day in alcohol-dependent persons. Chronobiol. Int. 20, 1093-1102 (2003).
- Kapfhamer, D., et al. Taok2 controls behavioral response to ethanol in mice. Genes, brain, and behavior. 12 (1), 87-97 (2012).
- Lasek, A. W., et al. An evolutionary conserved role for anaplastic lymphoma kinase in behavioral responses to ethanol. PLoS One. 6, 226-236 (2011).
- Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
- Lyons, L. C., Roman, G. Circadian modulation of short-term memory in Drosophila. Learning & Memory. 16, 19-27 (2009).
- Hamblen-Coyle, M. J., Wheeler, D. A., Rutila, J. E., Rosbash, M., Hall, J. C. Behavior of period-altered circadian-rhythm mutants of Drosophila in ligh-dark cycles (Diptera Drosophilidae). J. Insect Behav. 5, 417-446 (1992).
- Konopka, R. J., Pittendrigh, C., Orr, D. Reciprocal behavior associated with altered homeostasis and photosensitivity of Drosophila clock mutants. J. Neurogenet. 6, 1-10 (1989).
- Power, J. M., Ringo, J. M., Dowse, H. B. The effects of period mutations and light on the activity rhythms of Drosophila melanogaster. Journal of Biological Rhythms. 10, 267-280 (1995).
- Yoshii, T., et al. Temperature cycles drive Drosophila circadian oscillation in constant light that otherwise induces behavioural arrhythmicity. Eur. J. Neurosci. 22, 1176-1184 (2005).
- Berger, K. H., Heberlein, U., Moore, M. S. Rapid and chronic: two distinct forms of ethanol tolerance in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 28, 1469-1480 (2004).
- Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. M., Heberlein, U. Functional ethanol tolerance in Drosophila. Neuron. 28, 261-271 (2000).
- Kong, E. C., et al. Ethanol-regulated genes that contribute to ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 34, 302-316 (2010).
- Borycz, J., Borycz, J., Kubow, A., Lloyd, V., Meinertzhagen, I. Drosophila ABC transporter mutants white, brown and scarlet have altered contents and distribution of biogenic amines in the brain. J. Exp. Biol. 211, 3454-3466 (2008).
- Sitaraman, D., et al. Serotonin is necessary for place memory in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 5579-5584 (2008).
- Bainton, R. J., et al. Dopamine modulates acute responses to cocaine, nicotine and ethanol in Drosophila. Current Biology. 10, 187-194 (2000).
- Kong, E. C., et al. A pair of dopamine neurons target the D1-like dopamine receptor DopR in the central complex to promote ethanol-stimulated locomotion in Drosophila. Plos One. 5, (2010).
- Xu, J., Kochanek, K. D., Murphy, S. L., Tejada-Vera, B. . Deaths: Final data for 2007. , (2010).
- . The National Center on Addiction and Substance Abuse. Shoveling up II: The impact of substance abuse on federal, state and local budgets. , (2009).
- NIAAA, Estimated economic costs of alcohol abuse in the United States. , (1992).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Preferential ethanol consumption in Drosophila models features of addiction. Current Biology. 19, 2126-2132 (2009).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Addiction-like behavior in Drosophila. Communicative & Integrative Biology. 3, 357-359 (2010).
- Rodan, A. R., Rothenfluh, A. The genetics of behavioral alcohol responses in Drosophila. International Review of Neurobiology. 91, 25-51 (2010).
- Boothroyd, C. E., Young, M. W., Pfaff, D. W., Kieffer, B. Molecular and Biophysical Mechanisms of Arousal, Alertness, and Attention. Annals of the New York Academy of Sciences. 1129, 350-357 (2008).
- Nitabach, M. N., Taghert, P. H. Organization of the Drosophila circadian control circuit. Current Biology. 18, 84-93 (2008).
- Sheeba, V. The Drosophila melanogaster circadian pacemaker circuit. J. Genet. 87, 485-493 (2008).
- Cohan, F. M., Graf, J. -. D. Latitudinal cline in Drosophila melanogaster for knockdown resistance to ethanol fumes and for rates of response to selection for further resistance. Evolution. , 278-293 (1985).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
- Berger, K. H., et al. Ethanol sensitivity and tolerance in long-term memory mutants of Drosophila melanogaster. Alcohol Clin Exp Res. 32, 895-908 (2008).
- Pohl, J. B., et al. Circadian Genes Differentially Affect Tolerance to Ethanol. in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. , (2013).
- Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33, 1794-1805 (2009).
- Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, (1016).
