A estimulação do nervo infravermelho tem sido proposto como uma alternativa para a estimulação eléctrica em uma variedade de tipos de nervos, incluindo os que estão associados ao sistema auditivo. Este protocolo descreve um método de patch clamp para estudar o mecanismo da estimulação do nervo no infravermelho de uma cultura de neurónios auditivos primários.
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Artigo de método
Todo patch clamp celular para investigar os mecanismos de estimulação neural Infrared
Neste artigo
Resumo
Resumo
Demonstrou-se em anos recentes que pulsado, o laser de infravermelhos podem ser utilizadas para induzir respostas eléctricas em tecido neural, independente de qualquer outra modificação do tecido alvo. Estimulação neural de infravermelho foi relatada numa variedade de tecido neural periférico e sensorial in vivo, com particular interesse mostrado na estimulação de neurónios do nervo auditivo. No entanto, enquanto que o INS foi mostrado para trabalhar nestas configurações, o mecanismo (ou os mecanismos) pelo qual a luz infravermelha provoca excitação neuronal não é actualmente bem compreendido. O protocolo aqui apresentado descreve um método de fixação de membranas de células inteiras concebido para facilitar a investigação de estimulação neural infravermelhos em cultura neurónios auditivos primários. Por caracterizar completamente a resposta destas células a iluminação laser infravermelho, in vitro, sob condições controladas, pode ser possível obter uma melhor compreensão da physica fundamentaisl e os processos bioquímicos subjacentes estimulação neural por infravermelhos.
Introdução
Os campos da neurofisiologia e biônica médica dependem fortemente de técnicas que permitem a estimulação controlável de respostas elétricas no tecido neural. Enquanto a estimulação elétrica continua sendo o padrão ouro em excitação neural, sofre de uma série de inconvenientes, tais como a presença de artefatos de estímulo durante a gravação de respostas neurais, e uma falta de especificidade estimulação devido à propagação de corrente em um tecido circundante.
As duas últimas décadas têm visto o desenvolvimento de técnicas de estimulação opticamente mediadas 2. Várias destas técnicas requerem a modificação do tecido-....
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Protocolo
1. Cultura de neurônios do gânglio espiral
- Esterilizar redonda pequena (por exemplo, 10 mm de diâmetro) lamínulas de vidro e uma pinça curva em uma autoclave. Transferir as lamelas esterilizadas em poços individuais de uma solução estéril de 4 anéis placa de petri de 35 milímetros ou placa de 4 poços, utilizando as pinças esterilizadas. Aplicar 150 ul de poli-L-ornitina (500 ug / ml) e laminina rato (0,01 mg / ml) para a superfície superior da lamela e colocar numa incubadora (37 ° C) durante até 48 horas. Assegurar que as lamelas não flutuem a partir do fundo do poço.
- Preparar 50 ml de meio Neurobasal estéreis (NBM) de cada cultura neur....
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Resultados
Neurónios do gânglio espiral respondem à iluminação laser com formas de onda repetíveis em ambos tensão braçadeira e configurações de gravação actual-clamp. Figura 3a mostra alterações típicas na corrente de fluxo através de uma membrana celular, em resposta a um 2,5 ms, 0,8 mJ impulso laser (de resposta média de 6 pulsos de laser, repetido a intervalos de 1 segundo), com o potencial de membrana realizada a -70 mV, -60 mV e -50 mV. Correntes internas líquidas são constantemente evocadas em resposta a pu.......
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Discussão
Utilizando os protocolos descritos neste documento, é possível extrair e cultura de neurônios do gânglio espiral e investigar evocadas laser de atividade elétrica através da realização de experimentos de patch clamp de células inteiras. Quando usado in vitro, a técnica de fixação de membranas oferece um nível de controlo sobre os parâmetros experimentais, que não é alcançável in vivo. Parâmetros de estimulação a laser, tais como comprimento de onda, a energia de pulso, comprimento de pulso, a forma de .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo Conselho de Pesquisa Australiano sob Linkage Projeto concessão LP120100264.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Materiais e equipamentos de cultura de células | |||
| Lamínulas de vidro | Lomb Scientific | CSC 10 1 GP | |
| 4-ring cell culture plate | VWR International | 82050-542 | |
| Solução de poli-L-ornitina | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Curvo pinça | WPI | 14101 | Dumont #5 (ponta angular de 45°) |
| CO2 Incubadora | ThermoScientific | Heracell 150i | |
| Tabela 1. Materiais e equipamentos para cultura de células. | |||
| Meios neurobasais | |||
| Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
| N-2 suplemento | Invitrogen | 17502-048 | |
| B27 suplemento sem soro | Invitrogen | 17504-044 | |
| Penicilina-estreptomicina | Invitrogen | 15140-148 | |
| L-Glutamina | Invitrogen | 25030-149 | |
| Solução intracelularCloreto de | |||
| potássio | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| D-gluconato de potássio | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| Hidróxido de potássio | LabServ | BSPPL738.500 | |
| Sacarose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Solução extracelular | |||
| Cloreto de sódio | Sigma-Aldrich | 310166 | |
| Cloreto de potássio | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Cloreto de cálcio | Sigma-Aldrich | 383147 | |
| Cloreto de magnésio | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hidróxido de sódio | LabServ | BSPSL740.500 | |
| Sacarose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Tabela 2. Soluções para cultura de células e patch clamp. a) Meios neurobasais. b) Solução intracelular. c) Solução extracelular. | |||
| Microscópio vertical | Zeiss | AxioExaminerD1 | Equipado com contraste Dodt |
| Objetiva de imersão em água | Zeiss | W Plan-APOCHROMAT 40x/0,75 | |
| Plataforma e estágio X-Y | ThorLabs | Burleigh Gibraltar | |
| Câmara de gravação | Warner Instruments | RC-26G | |
| Mesa de isolamento de vibração | TMC | Micro-g 63-532 | |
| Instrumentos de diagnóstico | de câmera | CCD RT1200 | |
| Software da câmera | Instrumentos de diagnóstico | SPOT Basic | |
| In-line solução aquecedor | SH-27B | ||
| Controlador de temperatura | Warner | TC-324B | |
| Patch braçadeira amplificador | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Patch clamp sistema de aquisição de dados | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Micromanipulador | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Vidro de micropipeta | Sutter Instruments | GBF100-58-15 | Vidro de borosilicato com filamento |
| Extrator de micropipeta | Sutter Instruments | P2000 | |
| Software de gravação | AxoGraph | Lab pack e ferramentas de eletrofisiologia | |
| Frasco aspirador | Sigma-Aldrich | CLS12201L | 1 L Frasco aspirador Pyrex, com saída para tubulação |
| Tubo PE | Harvard | PolyE #340 | |
| Bomba peristáltica Masterflex | Cole-Parmer | HV-07554-85 | |
| Tabela 3.Patch clamp equipment. | |||
| 1.870 nm diodo laser | Optotech | ||
| 200/220 μ Cabo de remendo de fibra óptica multimodo de diâmetro m (FC/PC) | AFW Technologies | MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 | Fibra óptica de entrega leve, núcleo de sílica e revestimento, 0,22 NA |
| Fibra óptica através do conector (FC/PC) | Thorlabs | ADAFC2 | |
| Cutelo de fibra óptica | EREM | FO1 | |
| Ferramenta de decapagem de fibra óptica (0,25 - 0,6 mm) | Siemens | Para remover o revestimento de fibra óptica | |
| Ferramenta de decapagem de fibra óptica (0,6 - 1,0 mm) | Siemens | Para remover o revestimento externo do patch cord | |
| Gerador | Qualquer gerador de sinal que possa produzir as formas de pulso necessárias e seja capaz de ser acionado externamente | ||
| Posicionador de fibra óptica Posicionador | feito sob medida. Pode substituir o microposicionador padrão usado para experimentos de patch clamp | ||
| Mandril de fibra óptica | Newport | FPH-DJ | |
| Medidor de potência a laser e cabeça do detector | Coherent | FieldMate (medidor de potência) com LM-3 (cabeça do detector) | |
| Tabela 4. Equipamento a laser.< / forte> |
Referências
- Wells, J., Kao, C., Jansen, E. D., Konrad, P., Mahadevan-Jansen, A. Application of infrared light for in vivo neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 10, 064003(2005).
- Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Neural stimulation with optical rad....
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Reimpressões e permissões
