Hele Cell Patch Clamp for Undersøgelse af mekanismerne i Infrarød Neural Stimulation
Summary
Infrarød nerve stimulation er blevet foreslået som et alternativ til elektrisk stimulering i en række nerve typer, herunder dem der er forbundet med det auditive system. Denne protokol beskriver en patch-clamp-metode til at studere den mekanisme af infrarøde nervestimulation i en kultur af primære auditive neuroner.
Abstract
Det er blevet påvist i de senere år, at pulserende, infrarødt laserlys kan anvendes til at fremkalde elektriske reaktioner i nervevæv, uafhængigt af enhver yderligere ændring af målvævet. Infrarød neural stimulation er blevet rapporteret i en række af perifert og sensorisk neurale væv in vivo, med særlig interesse for stimulering af neuroner i hørenerven. Men mens INS har vist sig at fungere i disse indstillinger, er mekanismen (eller mekanismer), hvorved infrarødt lys forårsager neurale excitation øjeblikket ikke godt forstået. Protokollen præsenteres her beskriver en hel celle patch clamp metode designet til at lette efterforskningen af infrarød neural stimulation i dyrkede primære auditive neuroner. Ved grundigt kendetegnende respons af disse celler til infrarød laserbelysning in vitro under kontrollerede betingelser, kan det være muligt at opnå en bedre forståelse af den grundlæggende physical og biokemiske processer bag infrarød neural stimulation.
Introduction
Felterne i neurofysiologi og medicinske bionik stærkt afhængige teknikker, der tillader kontrollerbar stimulation af elektriske reaktioner i nervevæv. Mens elektrisk stimulation fortsat guldstandarden i neural excitation, det lider af en række ulemper som f.eks tilstedeværelsen af stimulation artefakter, når du optager neurale reaktioner, og mangel på stimulation specificitet på grund af spredningen af strøm i det omgivende væv 1..
De sidste to årtier har set udviklingen af optisk medierede stimulering teknikker 2. Adskillige af disse teknikker kræver ændring af målvævet, enten via tilsætning af et bestemt molekyle (f.eks bur molekyler) 3 eller anden form for genetisk manipulation (f.eks optogenetics) 4, hverken som er lette at anvende uden for et forskningsmiljø. Af særlig interesse er derfor infrarød neural stimulation (INS), whereby nervevæv er begejstret ved pulserende infrarødt laserlys. INS har potentiale til at overvinde mange af manglerne ved elektrisk stimulation ved at give meget specifikke, ikke-kontakt stimulering af nervevæv 2. Men mens INS er blevet påvist i en række indstillinger i vivo, den præcise mekanisme for excitation fortsat usikker.
Nogle af de seneste udgivelser har vist fremskridt i retning af at afdække mekanismen bag INS 5-7. Hurtig opvarmning skyldes absorption af laserlyset af vand synes at spille en central rolle. Men ud over dette er en konsensus er endnu ikke nået. Shapiro et al. 7. foreslå en meget generel mekanisme, hvorved hurtig opvarmning forårsager en forstyrrelse i fordelingen af ladede partikler støder op til cellemembranen, hvilket fører til en ændring i kapacitansen af cellemembranen og efterfølgende depolarisering. Hertil kommer,. Albert et al 5. hævder, at laser induceret opvarmning aktiverer en specifik klasse af temperaturfølsomme ionkanaler (forbigående receptor potentielle vanilloid kanaler), tillader ioner at passere gennem cellemembranen. På dette stadium er det uklart, hvordan disse mekanismer kombinere eller endog hvorvidt der er yderligere faktorer, der endnu ikke er identificeret.
Selv et lille antal publikationer (referencer 5,7-9) har undersøgt INS in vitro, har det store flertal af arbejde offentliggjort i dette område er blevet udført in vivo (f.eks referencer 1,6,10-18). Infrarød stimulering af auditive neuroner har været et område af særlig interesse på grund af de potentielle anvendelser i cochlear implantater 10,14-18. Mens in vivo forsøg er vigtige for at kontrollere effektiviteten af teknikken i forskellige indstillinger, den øgede grad af kontrol ydes af in vitro-undersøgelser forventes at føre til en mere detaljeret forståelse af mechnisme ansvarlig for INS. Denne rapport beskriver fremstillingen af dyrkede spiral ganglion neuroner patch clamp undersøgelser, da disse kan bruges til at undersøge grundlæggende mekanismer samtidig linker til den omfattende samling af eksisterende data fra det auditive system.
Plasteret clamp teknik er et fremragende værktøj til undersøgelser af elektrofysiologiske fænomener, hvilket giver en anordning til registrering af elektrisk aktivitet i enkelte celler og studere bidrag i de enkelte underliggende strømninger 19. Når denne teknik anvendes til en stabil in vitro forberedelse af primære neuroner, såsom dyrkede spiral ganglion neuroner, det giver mulighed for at studere i dybden de mekanismer, som neurale aktivitet styres og manipuleres.
Protokoller, i dette arbejde skitsere metoder til at undersøge effekten af laser stimulation på de elektriske egenskaber af spiral ganglion neuroner via patch clampoptagelser. Den fremgangsmåde er baseret på et fiber-koblet laser snarere end en fri-rum laser, der giver sikrere drift samt lettere og mere gentagelig tilpasning uden behov for at ændre standard mikroskop konfiguration. På grundlag af disse protokoller, bør det være muligt at foretage en lang række eksperimenter med henblik på mere klart at bestemme mekanismen eller mekanismerne bag INS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anvendelse af de protokoller, der er skitseret i dette dokument, er det muligt at udtrække og kultur spiral ganglion neuroner og til at undersøge laser-fremkaldt elektrisk aktivitet ved at udføre helcelle patch clamp eksperimenter. Når det bruges i vitro patch clamp-teknikken giver et niveau af kontrol over eksperimentelle parametre, som ikke kan opnås in vivo. Laser stimulering parametre såsom bølgelængde, puls energi, puls længde, puls form og pulsrepetitions sekvenser kan studeres i en repr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af den australske forskningsråd under Linkage Projektbevilling LP120100264.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials and equipment | |||
| Glass coverslips | Lomb Scientific | CSC 10 1 GP | |
| 4-ring cell culture dish | VWR International | 82050-542 | |
| Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Curved forceps | WPI | 14101 | Dumont #5 tweezers (45° angle tip) |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Heracell 150i | |
| Table 1. Cell culture materials and equipment. | |||
| Neurobasal media | |||
| Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-148 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-149 | |
| Intracellular solution | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Potassium D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| Potassium hydroxide | LabServ | BSPPL738.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Extracellular solution | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 310166 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 383147 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Sodium hydroxide | LabServ | BSPSL740.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution. | |||
| Upright microscope | Zeiss | AxioExaminerD1 | Equipped with Dodt contrast |
| Water-immersion objective | Zeiss | W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75 | |
| Platform and X-Y stage | ThorLabs | Burleigh Gibraltar | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Vibration isolation table | TMC | Micro-g 63-532 | |
| CCD Camera | Diagnostic Instruments | RT1200 | |
| Camera software | Diagnostic Instruments | SPOT Basic | |
| In-line solution heater | Warner | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner | TC-324B | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Patch clamp data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Micropipette glass | Sutter Instruments | GBF100-58-15 | Borosilicate glass with filament |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P2000 | |
| Recording Software | AxoGraph | Lab pack and electrophysiology tools | |
| Aspirator bottle | Sigma-Aldrich | CLS12201L | 1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing |
| PE Tubing | Harvard | PolyE #340 | |
| Masterflex peristaltic pump | Cole-Parmer | HV-07554-85 | |
| Table 3.Patch clamp equipment. | |||
| 1,870 nm laser diode | Optotech | ||
| 200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC) | AFW Technologies | MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 | Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA |
| Optical fiber through connector (FC/PC) | Thorlabs | ADAFC2 | |
| Optical fiber cleaver | EREM | FO1 | |
| Optical fiber stripping tool (0.25 – 0.6 mm) | Siemens | For removing optical fiber jacket | |
| Optical fiber stripping tool (0.6 – 1.0 mm) | Siemens | For removing outer coating of patch cord | |
| Signal generator | Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered | ||
| Optical fiber positioner | Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments | ||
| Optical fiber chuck | Newport | FPH-DJ | |
| Laser power meter and detector head | Coherent | FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head) | |
| Table 4. Laser equipment. |
Referências
- Wells, J., Kao, C., Jansen, E. D., Konrad, P., Mahadevan-Jansen, A. Application of infrared light for in vivo neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 10, 064003 (2005).
- Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Neural stimulation with optical radiation. Laser & Photonics Reviews. 5, 68-80 (2011).
- Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. New photochemical tools for controlling neuronal activity. Current Opinion in Neurobiology. 19, 544-552 (2009).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Albert, E. S., et al. Trpv4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons. Journal of Neurophysiology. 107, 3227-3234 (2012).
- Wells, J., et al. Biophysical mechanisms of transient optical stimulation of peripheral nerve. Biophysical Journal. 93, 2567-2580 (2007).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -. P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 3, 736 (2012).
- Bec, J. -. M., et al. Characteristics of laser stimulation by near infrared pulses of retinal and vestibular primary neurons. Lasers in Surgery and Medicine. 44, 736-745 (2012).
- Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes. Journal of Physiology (London). 589, 1295-1306 (2011).
- Izzo, A. D., et al. Laser stimulation of auditory neurons: Effect of shorter pulse duration and penetration depth. Biophysical Journal. 94, 3159-3166 (2008).
- Wells, J., Konrad, P., Kao, C., Jansen, E. D., Mahadevan-Jansen, A. Pulsed laser versus electrical energy for peripheral nerve stimulation. Journal of Neuroscience Methods. 163, 326-337 (2007).
- Teudt, I. U., Nevel, A. E., Izzo, A. D., Walsh, J. T., Richter, C. P. Optical stimulation of the facial nerve: A new monitoring technique. Laryngoscope. 117, 1641-1647 (2007).
- Jenkins, M. W., et al. Optical pacing of the embryonic heart. Nature Photonics. 4, 623-626 (2010).
- Izzo, A. D., Richter, C. P., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Laser stimulation of the auditory nerve. Lasers in Surgery and Medicine. 38, 745-753 (2006).
- Izzo, A. D., et al. Selectivity of neural stimulation in the auditory system: A comparison of optic and electric stimuli. J. Biomed. Opt. 12, 021008 (2007).
- Richter, C. P., et al. Optical stimulation of auditory neurons: Effects of acute and chronic deafening. Hearing Research. 242, 42-51 (2008).
- Littlefield, P. D., Vujanovic, I., Mundi, J., Matic, A. I., Richter, C. P. Laser stimulation of single auditory nerve fibers. Laryngoscope. 120, 2071-2082 (2010).
- Izzo, A. D., et al. Optical parameter variability in laser nerve stimulation: A study of pulse duration, repetition rate, and wavelength. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54, 1108-1114 (2007).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable-membranes. Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O’Leary, S. J. Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents. Hearing Research. 291, 1-14 (2012).
- Coleman, B., Fallon, J. B., Pettingill, L. N., de Silva, M. G., Shepherd, R. K. Auditory hair cell explant co-cultures promote the differentiation of stem cells into bipolar neurons. Experimental Cell Research. 313, 232-243 (2007).
- Whitlon, D. S., et al. Survival and morphology of auditory neurons in dissociated cultures of newborn mouse spiral ganglion. Neurociência. 138, 653-662 (1016).
- Vieira, M., Christensen, B. L., Wheeler, B. C., Feng, A. S., Kollmar, R. Survival and stimulation of neurite outgrowth in a serum-free culture of spiral ganglion neurons from adult mice. Hearing Research. 230, 17-23 (2007).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. B. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti. J. Vis. Exp. (36), e1685 (2010).
- Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 17, 075002 (2012).
- Snyder, A. W., Love, J. D. . Optical Waveguide Theory. , (1983).
- Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modelling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 18, 035004-0310 (2013).
- Yao, J., Liu, B. Y., Qin, F. Rapid temperature jump by infrared diode laser irradiation for patch-clamp studies. Biophysical Journal. 96, 3611-3619 (2009).
