Cellula intera Patch Clamp per lo studio dei meccanismi di Infrared Stimolazione Neurale
Summary
Stimolazione nervosa infrarossi è stato proposto come alternativa alla stimolazione elettrica in una gamma di tipi nervose, comprese quelle associate al sistema uditivo. Questo protocollo descrive un metodo patch clamp per studiare il meccanismo di stimolazione nervosa infrarossa in una cultura di neuroni uditivi primari.
Abstract
È stato dimostrato negli ultimi anni che pulsata, luce laser infrarosso può essere utilizzato per ottenere risposte elettrici nel tessuto neurale, indipendente da qualsiasi ulteriore modifica del tessuto bersaglio. Stimolazione neurale infrarossi è stato riportato in una varietà di tessuto neurale e sensoriali periferici in vivo, con particolare interesse mostrato nella stimolazione di neuroni nel nervo uditivo. Tuttavia, mentre INS ha dimostrato di funzionare in queste impostazioni, il meccanismo (o meccanismi) attraverso il quale la luce infrarossa causa l'eccitazione neurale è attualmente poco compreso. Il protocollo presentato qui descrive un metodo di patch clamp cellula intera progettato per facilitare le indagini di stimolazione neurale infrarossi in colture di neuroni uditivi primari. Dal fondo caratterizzare la risposta di queste cellule di illuminazione laser infrarosso in vitro in condizioni controllate, può essere possibile ottenere una migliore comprensione del physica fondamentalel ed i processi biochimici sottostanti stimolazione neurale infrarossi.
Introduction
I campi della neurofisiologia e della bionica medica si basano molto sulle tecniche che consentono la stimolazione controllabile di risposte elettriche nei tessuti nervosi. Mentre la stimolazione elettrica rimane il gold standard nella eccitazione neurale, soffre di una serie di inconvenienti, quali la presenza di artefatti di stimolazione quando si registra risposte neurali, e una mancanza di stimolazione specificità dovuta alla diffusione di corrente nel tessuto circostante 1.
Gli ultimi due decenni hanno visto lo sviluppo di tecniche di stimolazione otticamente mediate 2. Molte di queste tecniche richiede modificazione del tessuto bersaglio, tramite l'aggiunta di una particolare molecola (molecole es gabbia) 3 o qualche forma di manipolazione genetica (es. optogenetics) 4, nessuno dei quali è facilmente applicabile al di fuori di un ambiente di ricerca. Di particolare interesse è dunque stimolazione neurale infrarossi (INS), whereby tessuto neurale è eccitato dalla luce laser infrarossa pulsata. INS ha il potenziale per superare molte delle carenze della stimolazione elettrica, consentendo altamente specifico, senza contatto stimolazione del tessuto neurale 2. Tuttavia, mentre INS è stata dimostrata con successo in una varietà di impostazioni in vivo, il meccanismo preciso di eccitazione rimane incerta.
Alcune pubblicazioni recenti hanno dimostrato progressi verso scoprire il meccanismo che sta dietro INS 5-7. Rapido riscaldamento dovuto all'assorbimento della luce laser da acqua sembra giocare un ruolo chiave. Tuttavia, al di là di questo un consenso deve ancora essere raggiunto. Shapiro et al. 7 propongono un meccanismo molto generale che riscaldamento rapido provoca una perturbazione nella distribuzione di particelle cariche adiacenti alla membrana cellulare, portando ad una variazione della capacità della membrana cellulare e conseguente depolarizzazione. Inoltre, Albert et al. 5 affermare che Laser riscaldamento indotto attiva una specifica classe di temperatura canali ionici sensibili (recettore vanilloide potenziale transiente canali), permettendo agli ioni di passare attraverso la membrana cellulare. In questa fase non è chiaro come questi meccanismi combinano, o anche se vi sono ulteriori fattori che sono ancora da identificare.
Anche se un piccolo numero di pubblicazioni (riferimenti 5,7-9) hanno indagato INS in vitro, la stragrande maggioranza dei lavori pubblicati in questo campo è stata effettuata in vivo (ad es riferimenti 1,6,10-18). Stimolazione infrarossi dei neuroni uditivi è stata una zona di particolare interesse, a causa delle potenziali applicazioni in impianti cocleari 10,14-18. Mentre esperimenti in vivo sono importanti per verificare l'efficacia della tecnica in varie impostazioni, l'aumento del livello di controllo offerta da studi in vitro dovrebbe portare ad una comprensione più dettagliata del meccanismosmo responsabile INS. Questo rapporto descrive la preparazione di colture di neuroni del ganglio spirale per le indagini di patch clamp, in quanto questi possono essere utilizzati per studiare i meccanismi fondamentali, mentre anche il collegamento per la grande quantità di dati esistenti dal sistema uditivo.
La tecnica patch clamp è un eccellente strumento per ricerche di fenomeni elettrofisiologici, fornendo un mezzo di registrazione dell'attività elettrica in cellule singole e studiando il contributo delle singole correnti sottostanti 19. Quando questa tecnica viene applicata a una stalla de preparazione in vitro di neuroni primari come coltura spirale neuroni gangliari, che offre l'opportunità di studiare in modo approfondito i meccanismi con cui l'attività neurale è controllato e manipolato.
I protocolli specificati in questo lavoro metodi di contorno per investigare l'effetto della stimolazione laser sulle proprietà elettriche dei neuroni del ganglio spirale attraverso Patch Clampregistrazioni. L'approccio è basato su un laser accoppiato in fibra piuttosto che un laser a spazio libero, consentendo un funzionamento più sicuro e più facile e più ripetibile allineamento senza la necessità di modificare la configurazione microscopio standard. Sulla base di questi protocolli, dovrebbe essere possibile effettuare una vasta gamma di esperimenti per determinare con maggiore precisione il meccanismo o meccanismi dietro INS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilizzando i protocolli descritti in questo documento è possibile estrarre e cultura spirale neuroni gangliari e di indagare laser evocata attività elettrica eseguendo interi esperimenti di patch clamp cellulari. Quando utilizzato in vitro, la tecnica patch clamp fornisce un livello di controllo sui parametri sperimentali che non è realizzabile in vivo. Parametri di stimolazione laser come lunghezza d'onda, di impulsi di energia, lunghezza di impulso, forma d'impulso, e sequenze di ripetizi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Consiglio di Ricerca Australiano sotto Linkage Progetto concessione LP120100264.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials and equipment | |||
| Glass coverslips | Lomb Scientific | CSC 10 1 GP | |
| 4-ring cell culture dish | VWR International | 82050-542 | |
| Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Curved forceps | WPI | 14101 | Dumont #5 tweezers (45° angle tip) |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Heracell 150i | |
| Table 1. Cell culture materials and equipment. | |||
| Neurobasal media | |||
| Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-148 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-149 | |
| Intracellular solution | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Potassium D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| Potassium hydroxide | LabServ | BSPPL738.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Extracellular solution | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 310166 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 383147 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Sodium hydroxide | LabServ | BSPSL740.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution. | |||
| Upright microscope | Zeiss | AxioExaminerD1 | Equipped with Dodt contrast |
| Water-immersion objective | Zeiss | W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75 | |
| Platform and X-Y stage | ThorLabs | Burleigh Gibraltar | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Vibration isolation table | TMC | Micro-g 63-532 | |
| CCD Camera | Diagnostic Instruments | RT1200 | |
| Camera software | Diagnostic Instruments | SPOT Basic | |
| In-line solution heater | Warner | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner | TC-324B | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Patch clamp data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Micropipette glass | Sutter Instruments | GBF100-58-15 | Borosilicate glass with filament |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P2000 | |
| Recording Software | AxoGraph | Lab pack and electrophysiology tools | |
| Aspirator bottle | Sigma-Aldrich | CLS12201L | 1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing |
| PE Tubing | Harvard | PolyE #340 | |
| Masterflex peristaltic pump | Cole-Parmer | HV-07554-85 | |
| Table 3.Patch clamp equipment. | |||
| 1,870 nm laser diode | Optotech | ||
| 200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC) | AFW Technologies | MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 | Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA |
| Optical fiber through connector (FC/PC) | Thorlabs | ADAFC2 | |
| Optical fiber cleaver | EREM | FO1 | |
| Optical fiber stripping tool (0.25 – 0.6 mm) | Siemens | For removing optical fiber jacket | |
| Optical fiber stripping tool (0.6 – 1.0 mm) | Siemens | For removing outer coating of patch cord | |
| Signal generator | Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered | ||
| Optical fiber positioner | Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments | ||
| Optical fiber chuck | Newport | FPH-DJ | |
| Laser power meter and detector head | Coherent | FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head) | |
| Table 4. Laser equipment. |
Referências
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