Hele Cell Patch Clamp for Gransker Mekanismer for Infrared Neural Stimulering
Summary
Infrarød nerve stimulering har vært foreslått som et alternativ til elektrisk stimulering i en rekke nerve typer, inkludert de som er forbundet med det auditive system. Denne protokollen beskriver en patch klemme metode for å studere mekanismen av infrarød nerve stimulering i en kultur av primære auditive nevroner.
Abstract
Det har blitt demonstrert i de senere år at pulset, infrarød laser lys kan benyttes for å avstedkomme elektriske responser i nervevev, uavhengig av en ytterligere modifikasjon av målvevet. Infrarød nevrale stimulering har blitt rapportert i en rekke perifere og sensorisk nevrale vev in vivo, med spesiell interesse vist i stimulering av nerveceller i hørselsnerven. Men mens INS har vist seg å arbeide i disse innstillinger, er mekanismen (eller mekanismer) av infrarødt lys som forårsaker eksitasjon nevrale for tiden ikke fullt ut forstått. Protokollen presenteres her beskriver en hel celle patch clamp metode utviklet for å lette etterforskningen av infrarød nervestimulering i dyrkede primære auditive nevroner. Ved grundig å karakterisere responsen til disse cellene overfor infrarød laser belysning in vitro under kontrollerte forhold, kan det være mulig å oppnå en forbedret forståelse av den grunnleggende Physical og biokjemiske prosesser underliggende infrarød nevrale stimulering.
Introduction
Områdene nevrofysiologi og medisinsk bionics avhengige av teknikker som tillater kontrollerbar stimulering av elektriske reaksjoner i nervevev. Mens elektrisk stimulering forblir den gull-standarden i nevral magnetisering, lider det en rekke ulemper som nærvær av stimulering gjenstander ved opptak av nevrale responser, og en mangel på stimulering spesifisitet på grunn av spredning av strøm inn i pt omkringliggende vev.
De to siste tiårene har sett utviklingen av optisk medierte stimulering teknikker to. Flere av disse teknikker krever modifikasjon av målvevet, enten ved tilsetning av en bestemt molekyl (f.eks bur molekyler) 3 eller en eller annen form av genetisk manipulering (f.eks optogenetics) 4, verken som er lett å påføre utvendig av et forsknings-innstilling. Av spesiell interesse er derfor infrarød nervestimulering (INS), whereby nevrale vev er begeistret av pulset infrarødt laserlys. INS har potensial til å overvinne mange av svakhetene ved elektrisk stimulering ved at svært spesifikke, ikke-kontakt stimulering av nervevev to. Men mens INS har blitt vist i en rekke innstillinger i vivo, forblir den nøyaktige mekanismen for eksitasjon usikker.
Noen nyere publikasjoner har vist fremgang mot å avdekke mekanismen bak INS 5-7. Rask oppvarming på grunn av absorpsjon av laserlys ved vannet ser ut til å spille en nøkkelrolle. Men utover dette en konsensus er ennå ikke nådd. Shapiro et al. Syv foreslå en meget generell mekanisme hvorved hurtig oppvarming fører til en forstyrrelse i fordelingen av ladede partikler som grenser til cellemembranen, som fører til en endring i kapasitansen til cellemembranen og påfølgende depolarisering. I tillegg Albert et al. Fem hevde at laser indusert oppvarming aktiverer en spesifikk klasse av temperatursensitive ionekanaler (forbigående reseptor potensielle vanilloid kanaler), som tillater ioner å passere gjennom cellemembranen. På dette stadiet er det uklart hvordan disse mekanismene kombinere, eller faktisk om det er flere faktorer som ennå ikke er identifisert.
Selv om et lite antall publikasjoner (referanser 5,7-9) har undersøkt INS in vitro, har det store flertallet av arbeid publisert på dette feltet er utført in vivo (f.eks referanser 1,6,10-18). Infrarød stimulering av auditive nevroner har vært et område av spesiell interesse, på grunn av de potensielle anvendelser i cochlea implantat 10,14-18. Selv om in vivo-eksperimenter er det viktig å verifisere effektiviteten av teknikken i forskjellige innstillinger, det økte nivå av kontroll gis av in vitro-studier er ventet å føre til en mer detaljert forståelse av mekkraftig svingmekanisme ansvarlig for INS. Denne rapporten beskriver utarbeidelse av dyrkede spiral ganglion nevroner for patch clamp undersøkelser, da disse kan brukes til å studere grunnleggende mekanismer samtidig knytte til den store kroppen av eksisterende data fra det auditive system.
Plasteret klemme teknikken er et utmerket verktøy for undersøkelser av elektrofysiologiske fenomener, gir et middel for opptak elektrisk aktivitet i enkeltceller og studere bidraget fra de enkelte underliggende strømninger 19. Når denne teknikken er brukt på et stabilt in vitro utarbeidelse av primære nevroner, som for eksempel dyrkede spiral ganglion nevroner, og tilbyr muligheten til å studere i dybden de mekanismer som nevrale aktiviteten er kontrollert og manipulert.
Protokollene er spesifisert i dette arbeidet skissere metoder for å undersøke effekten av laser stimulering på de elektriske egenskapene til spiral ganglion nevroner gjennom patch clampinnspillinger. Fremgangsmåten er basert på en fiber-koplet laser i stedet for en fri-plass laser, slik at sikrere drift, så vel som enklere og mer repeterbar innretting uten behov for modifisering av standardmaskin mikroskop-konfigurasjon. På grunnlag av disse protokollene, bør det være mulig å gjennomføre en rekke eksperimenter for å klarere bestemme mekanismen eller mekanismene bak INS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ved hjelp av protokollene som er skissert i denne artikkelen er det mulig å trekke ut og kultur spiral ganglion nevroner og undersøke laser-fremkalt elektrisk aktivitet ved å utføre helcelle patch clamp eksperimenter. Når den brukes in vitro, gir plasteret klemmeteknikken en grad av kontroll over eksperimentelle parametere som ikke er oppnåelig in vivo. Laser stimulering parametere som bølgelengde, puls energi, puls lengde, puls form, og puls repetisjon sekvenser kan studeres i en reproduserbar …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av den australske Forskningsrådet i henhold Linkage Prosjekt stipend LP120100264.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials and equipment | |||
| Glass coverslips | Lomb Scientific | CSC 10 1 GP | |
| 4-ring cell culture dish | VWR International | 82050-542 | |
| Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Curved forceps | WPI | 14101 | Dumont #5 tweezers (45° angle tip) |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Heracell 150i | |
| Table 1. Cell culture materials and equipment. | |||
| Neurobasal media | |||
| Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-148 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-149 | |
| Intracellular solution | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Potassium D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| Potassium hydroxide | LabServ | BSPPL738.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Extracellular solution | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 310166 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 383147 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Sodium hydroxide | LabServ | BSPSL740.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution. | |||
| Upright microscope | Zeiss | AxioExaminerD1 | Equipped with Dodt contrast |
| Water-immersion objective | Zeiss | W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75 | |
| Platform and X-Y stage | ThorLabs | Burleigh Gibraltar | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Vibration isolation table | TMC | Micro-g 63-532 | |
| CCD Camera | Diagnostic Instruments | RT1200 | |
| Camera software | Diagnostic Instruments | SPOT Basic | |
| In-line solution heater | Warner | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner | TC-324B | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Patch clamp data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Micropipette glass | Sutter Instruments | GBF100-58-15 | Borosilicate glass with filament |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P2000 | |
| Recording Software | AxoGraph | Lab pack and electrophysiology tools | |
| Aspirator bottle | Sigma-Aldrich | CLS12201L | 1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing |
| PE Tubing | Harvard | PolyE #340 | |
| Masterflex peristaltic pump | Cole-Parmer | HV-07554-85 | |
| Table 3.Patch clamp equipment. | |||
| 1,870 nm laser diode | Optotech | ||
| 200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC) | AFW Technologies | MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 | Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA |
| Optical fiber through connector (FC/PC) | Thorlabs | ADAFC2 | |
| Optical fiber cleaver | EREM | FO1 | |
| Optical fiber stripping tool (0.25 – 0.6 mm) | Siemens | For removing optical fiber jacket | |
| Optical fiber stripping tool (0.6 – 1.0 mm) | Siemens | For removing outer coating of patch cord | |
| Signal generator | Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered | ||
| Optical fiber positioner | Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments | ||
| Optical fiber chuck | Newport | FPH-DJ | |
| Laser power meter and detector head | Coherent | FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head) | |
| Table 4. Laser equipment. |
Referências
- Wells, J., Kao, C., Jansen, E. D., Konrad, P., Mahadevan-Jansen, A. Application of infrared light for in vivo neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 10, 064003 (2005).
- Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Neural stimulation with optical radiation. Laser & Photonics Reviews. 5, 68-80 (2011).
- Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. New photochemical tools for controlling neuronal activity. Current Opinion in Neurobiology. 19, 544-552 (2009).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Albert, E. S., et al. Trpv4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons. Journal of Neurophysiology. 107, 3227-3234 (2012).
- Wells, J., et al. Biophysical mechanisms of transient optical stimulation of peripheral nerve. Biophysical Journal. 93, 2567-2580 (2007).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -. P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 3, 736 (2012).
- Bec, J. -. M., et al. Characteristics of laser stimulation by near infrared pulses of retinal and vestibular primary neurons. Lasers in Surgery and Medicine. 44, 736-745 (2012).
- Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes. Journal of Physiology (London). 589, 1295-1306 (2011).
- Izzo, A. D., et al. Laser stimulation of auditory neurons: Effect of shorter pulse duration and penetration depth. Biophysical Journal. 94, 3159-3166 (2008).
- Wells, J., Konrad, P., Kao, C., Jansen, E. D., Mahadevan-Jansen, A. Pulsed laser versus electrical energy for peripheral nerve stimulation. Journal of Neuroscience Methods. 163, 326-337 (2007).
- Teudt, I. U., Nevel, A. E., Izzo, A. D., Walsh, J. T., Richter, C. P. Optical stimulation of the facial nerve: A new monitoring technique. Laryngoscope. 117, 1641-1647 (2007).
- Jenkins, M. W., et al. Optical pacing of the embryonic heart. Nature Photonics. 4, 623-626 (2010).
- Izzo, A. D., Richter, C. P., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Laser stimulation of the auditory nerve. Lasers in Surgery and Medicine. 38, 745-753 (2006).
- Izzo, A. D., et al. Selectivity of neural stimulation in the auditory system: A comparison of optic and electric stimuli. J. Biomed. Opt. 12, 021008 (2007).
- Richter, C. P., et al. Optical stimulation of auditory neurons: Effects of acute and chronic deafening. Hearing Research. 242, 42-51 (2008).
- Littlefield, P. D., Vujanovic, I., Mundi, J., Matic, A. I., Richter, C. P. Laser stimulation of single auditory nerve fibers. Laryngoscope. 120, 2071-2082 (2010).
- Izzo, A. D., et al. Optical parameter variability in laser nerve stimulation: A study of pulse duration, repetition rate, and wavelength. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54, 1108-1114 (2007).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable-membranes. Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O’Leary, S. J. Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents. Hearing Research. 291, 1-14 (2012).
- Coleman, B., Fallon, J. B., Pettingill, L. N., de Silva, M. G., Shepherd, R. K. Auditory hair cell explant co-cultures promote the differentiation of stem cells into bipolar neurons. Experimental Cell Research. 313, 232-243 (2007).
- Whitlon, D. S., et al. Survival and morphology of auditory neurons in dissociated cultures of newborn mouse spiral ganglion. Neurociência. 138, 653-662 (1016).
- Vieira, M., Christensen, B. L., Wheeler, B. C., Feng, A. S., Kollmar, R. Survival and stimulation of neurite outgrowth in a serum-free culture of spiral ganglion neurons from adult mice. Hearing Research. 230, 17-23 (2007).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. B. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti. J. Vis. Exp. (36), e1685 (2010).
- Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 17, 075002 (2012).
- Snyder, A. W., Love, J. D. . Optical Waveguide Theory. , (1983).
- Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modelling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 18, 035004-0310 (2013).
- Yao, J., Liu, B. Y., Qin, F. Rapid temperature jump by infrared diode laser irradiation for patch-clamp studies. Biophysical Journal. 96, 3611-3619 (2009).
