Whole Cell Patch Clamp para investigar los mecanismos de la Estimulación Neural infrarrojos
Summary
La estimulación del nervio infrarrojos ha sido propuesta como una alternativa a la estimulación eléctrica en una gama de tipos de nervios, incluyendo los asociados con el sistema auditivo. Este protocolo describe un método de patch clamp para estudiar el mecanismo de estimulación nerviosa de infrarrojos en un cultivo de neuronas auditivas primarias.
Abstract
Se ha demostrado en los últimos años que la luz láser pulsado, infrarrojos puede ser utilizado para provocar respuestas eléctricas en el tejido neural, independiente de cualquier modificación adicional del tejido diana. Estimulación neural de infrarrojos ha sido reportado en una variedad de tejido neural periférica y sensorial in vivo, con particular interés se muestra en la estimulación de las neuronas en el nervio auditivo. Sin embargo, mientras que el INS se ha demostrado que funciona en esta configuración, el mecanismo (o mecanismos) por el cual la luz infrarroja provoca excitación neuronal está actualmente no se entiende bien. El protocolo presentado aquí describe un método de patch clamp de célula completa diseñada para facilitar la investigación de la estimulación neural de infrarrojos en las neuronas auditivas primarias cultivadas. Al caracterizar a fondo la respuesta de estas células a la iluminación láser infrarrojo in vitro bajo condiciones controladas, puede ser posible obtener una mejor comprensión de la Physica fundamentall y procesos bioquímicos subyacentes estimulación neural infrarrojos.
Introduction
Los campos de la neurofisiología y médica biónica dependen en gran medida en las técnicas que permiten la estimulación controlable de respuestas eléctricas en el tejido neural. Mientras que la estimulación eléctrica sigue siendo el estándar de oro en la excitación neuronal, que adolece de una serie de inconvenientes tales como la presencia de artefactos de estimulación cuando se graban las respuestas neurales, y la falta de especificidad de la estimulación debido a la propagación de la corriente en el tejido circundante 1.
Las últimas dos décadas han visto el desarrollo de técnicas de estimulación mediada ópticamente 2. Varias de estas técnicas requieren la modificación del tejido diana, ya sea a través de la adición de una molécula en particular (por ejemplo, moléculas de jaula) 3 o alguna forma de manipulación genética (por ejemplo, la optogenética) 4, ninguno de los cuales son fáciles de aplicar fuera de un contexto de investigación. De particular interés, por tanto, la estimulación neural infrarrojos (INS), whereby tejido nervioso se excita con luz láser infrarroja pulsada. INS tiene el potencial de superar muchas de las deficiencias de la estimulación eléctrica, permitiendo altamente específica, la estimulación sin contacto de tejido neural 2. Sin embargo, mientras que el INS se ha demostrado con éxito en una variedad de ajustes in vivo, el mecanismo preciso de la excitación sigue siendo incierto.
Algunas publicaciones recientes han mostrado un progreso hacia el descubrimiento del mecanismo detrás de INS 5-7. Calentamiento rápido debido a la absorción de la luz láser por el agua parece jugar un papel clave. Sin embargo, más allá de este consenso aún no se ha alcanzado. Shapiro et al. 7 proponen un mecanismo muy general según el cual el calentamiento rápido hace que una perturbación en la distribución de partículas cargadas adyacentes a la membrana celular, que conduce a un cambio en la capacitancia de la membrana celular y la posterior despolarización. Además, Albert et al. 5 afirman que lasecalefacción inducida r activa una clase específica de temperatura canales iónicos sensibles (receptor de potencial transitorio canales vaniloide), permitiendo que los iones pasen a través de la membrana celular. En esta etapa no está claro cómo se combinan estos mecanismos, o incluso si hay otros factores que aún no se han identificado.
Aunque un pequeño número de publicaciones (referencias 5,7-9) han investigado INS in vitro, la gran mayoría de los trabajos publicados en este campo se ha llevado a cabo in vivo (por ejemplo, referencias 1,6,10-18). Estimulación de las neuronas auditivas infrarrojos ha sido un área de particular interés, debido a las potenciales aplicaciones en implantes cocleares 10,14-18. Mientras que pt experimentos in vivo son importantes para verificar la eficacia de la técnica en diversos entornos, el aumento del nivel de control proporcionado por los estudios in vitro se espera que conduzca a una comprensión más detallada del mecanismonismo responsable de INS. Este informe describe la preparación de cultivos de neuronas del ganglio espiral para las investigaciones de patch clamp, ya que estos pueden ser utilizados para estudiar los mecanismos fundamentales mientras que también une a la gran cantidad de datos existentes en el sistema auditivo.
La técnica de patch clamp es una excelente herramienta para la investigación de los fenómenos electrofisiológicos, proporcionando un medio de registro de la actividad eléctrica en las células individuales y el estudio de la contribución de las corrientes subyacentes individuales 19. Cuando esta técnica se aplica a un establo pt la preparación in vitro de neuronas primarias, como las neuronas del ganglio espiral cultivadas, ofrece la oportunidad de estudiar en profundidad los mecanismos por los que la actividad neuronal es controlada y manipulada.
Los protocolos especificados en este trabajo se resumen los métodos para investigar el efecto de la estimulación con láser en las propiedades eléctricas de las neuronas del ganglio espiral a través de patch clampgrabaciones. El enfoque se basa en un láser de fibra de acoplamiento en lugar de un láser en el espacio libre, que permite un funcionamiento más seguro, así como más fácil y más repetible alineación sin la necesidad de modificar la configuración de microscopio estándar. Sobre la base de estos protocolos, debería ser posible llevar a cabo una amplia gama de experimentos con el fin de determinar más claramente el mecanismo o los mecanismos detrás de INS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Usando los protocolos descritos en este documento, es posible extraer y cultura neuronas del ganglio espiral y para investigar laser-evocó actividad eléctrica mediante la realización de experimentos de patch clamp de células enteras. Cuando se usa in vitro, la técnica de patch clamp proporciona un nivel de control sobre los parámetros experimentales que no es alcanzable in vivo. Parámetros de estimulación láser, tales como longitud de onda, energía de pulso, duración del pulso, forma del pul…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el Consejo Australiano de Investigación bajo Vinculación del proyecto de subvención LP120100264.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials and equipment | |||
| Glass coverslips | Lomb Scientific | CSC 10 1 GP | |
| 4-ring cell culture dish | VWR International | 82050-542 | |
| Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Curved forceps | WPI | 14101 | Dumont #5 tweezers (45° angle tip) |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Heracell 150i | |
| Table 1. Cell culture materials and equipment. | |||
| Neurobasal media | |||
| Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-148 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-149 | |
| Intracellular solution | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Potassium D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| Potassium hydroxide | LabServ | BSPPL738.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Extracellular solution | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 310166 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 383147 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Sodium hydroxide | LabServ | BSPSL740.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution. | |||
| Upright microscope | Zeiss | AxioExaminerD1 | Equipped with Dodt contrast |
| Water-immersion objective | Zeiss | W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75 | |
| Platform and X-Y stage | ThorLabs | Burleigh Gibraltar | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Vibration isolation table | TMC | Micro-g 63-532 | |
| CCD Camera | Diagnostic Instruments | RT1200 | |
| Camera software | Diagnostic Instruments | SPOT Basic | |
| In-line solution heater | Warner | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner | TC-324B | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Patch clamp data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Micropipette glass | Sutter Instruments | GBF100-58-15 | Borosilicate glass with filament |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P2000 | |
| Recording Software | AxoGraph | Lab pack and electrophysiology tools | |
| Aspirator bottle | Sigma-Aldrich | CLS12201L | 1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing |
| PE Tubing | Harvard | PolyE #340 | |
| Masterflex peristaltic pump | Cole-Parmer | HV-07554-85 | |
| Table 3.Patch clamp equipment. | |||
| 1,870 nm laser diode | Optotech | ||
| 200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC) | AFW Technologies | MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 | Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA |
| Optical fiber through connector (FC/PC) | Thorlabs | ADAFC2 | |
| Optical fiber cleaver | EREM | FO1 | |
| Optical fiber stripping tool (0.25 – 0.6 mm) | Siemens | For removing optical fiber jacket | |
| Optical fiber stripping tool (0.6 – 1.0 mm) | Siemens | For removing outer coating of patch cord | |
| Signal generator | Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered | ||
| Optical fiber positioner | Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments | ||
| Optical fiber chuck | Newport | FPH-DJ | |
| Laser power meter and detector head | Coherent | FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head) | |
| Table 4. Laser equipment. |
Referências
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