前列腺素的提取与分析<em>线虫</em

Summary

在本文中，我们描述了一个优化的过程，前列腺素等类花生酸类物质的提取和分析<em> C。线虫</em利用LC-MS/MS。

Abstract

线虫正在成为一个强大的动物模型来研究生物学脂质^1-9。前列腺素是一类重要的类二十烷酸，是脂质信号是来自于多不饱和脂肪酸^{（PUFAs）10-14。}这些信号分子是很难研究，因为他们的低丰度和反应性。前列腺素的特征是环戊烷环结构的位于脂肪酸骨干内。在哺乳动物中，前列腺素可以通过环加氧酶的酶-依赖性和非依赖性通路^10,15形成。C.线虫独立环氧合酶^6,16,17广泛的前列腺素合成。一个大F系列前列腺素类已经确定，但花生酸类物质的研究是在早期阶段有足够的空间，新的发现。在这里，我们描述了一个过程，前列腺素和其他类花生酸类物质的提取和分析。带电脂质s的提取从大量的蠕虫病毒培养，采用液 – 液萃取技术，液相色谱 – 电喷雾电离串联质谱（LC-ESI-MS/MS）分析。氘化的前列腺素类似物，如前列腺素F _{2α-d 4中}的夹杂物，作为内标，建议进行定量分析。可以使用多反应监测或MRM量化和比较野生型和突变型的动物之间的特定类型的前列腺素。碰撞诱导分解或MS / MS可以使用以获得有关的重要结构特征。液相色谱-质谱（LC-MS）调查选定的质量范围的扫描，如M / Z 315-360可以用来评估全球变化中的前列腺素水平。我们提供所有三个分析的例子。这些方法将为研究人员提供一个工具集，用于发现新的花生四烯酸，其代谢途径及划定。

Introduction

前列腺素（PGs的）是一类重要的脂质激素已被广泛地研究，并在调节再生，免疫和发展在广泛的生物体^12-14牵连。全面的系统生物学分析的PG非常适合，因为它们包含了一系列来自一个共同的前体（S）的血脂。线虫C.线虫遗传学和系统生物学来解决根本问题，是使用最广泛的模式生物之一。

我们已经证明，C。线虫综合F系列的PG，活动精子卵母细胞^3,6,16指南。已经确定，三个，四个，五个双键组成的F1，F2，和F3类，分别从20个碳的多不饱和脂肪酸衍生的前列腺素F系列^3,16。这些前列腺素合成独立环氧合酶尚未_PGF1α和_PGF2α立体的的，仍然GEnerated。 C.进行定性和定量分析线虫 PGS，LC-MS/MS是一个强大和敏感的分析技术。在执行这一分析之前，重要的是开发优化的提取方法，因为在分析过程的性能很大程度上依赖于提取物的质量。液相色谱法和质谱法只能提供预期的质荷比（M / Z），以及理想的峰形和保留时间为PG母离子。 C.前列腺素的代谢谱线虫是一项艰巨的任务，需要各种不同的MS收购策略。

LC-MS全扫描或调查扫描（Q1的扫描）确保，最电离的PG的生成质谱反应的优点。虽然调查扫描相对于野生型和突变型C.前列腺素的总分析提供有用的信息线虫 ，因轻微的前列腺素的检测灵敏度低。然而以下，液相色谱 – 质谱联用仪测量扫描可以给的全局视图的PG，用于分析预测影响代谢的一个大的PG人口的突变体是特别有用的。

在代谢物鉴定，LC-MS/MS分析化学合成PG标准是第一次演出，以取得他们的产品作为参考化合物离子光谱。这些光谱进行比较的一个未知的代谢物谱。多反应监测（MRM）模式用于增强的敏感性和特异性。 MRM实验中是通过指定母离子/产物离子质量的化合物过渡。通过了解的质量和目标分析物的结构，它是可以预测理论的MRM离子在很多未知的代谢物。

一个优化的LC-MS/MS方法分析异构前列腺素C.线虫尚未见报道。在这里，我们描述了一个提取和综合质谱法组成的LC-MS和LC-MS / MS方法进行检测，量化，并调查C.线虫 PG代谢产物。这种方法可以应用到其他的类二十烷酸。

Protocol

下文所述的协议被分为三个部分：蜗杆文化，前列腺素的提取，和前列腺素分析。正如所指出的，有多个点时，样品可以暂时存储在-80℃或-20℃。 1。蠕虫文化我们建议混合阶段全面LC-MS/MS蠕虫约6克。这应该提供足够的材料检测至少六个单独注射。对于定量分析的被称为PG的MRM在单次注射或两个1-2克就足够了。组成的一个特定的阶段的同步培养提取物的分析也是可能的。同时最多4个不同的菌株能够生长。例如，野生型控制和三个不同的突变株。 准备65 X大（16厘米）NGM板和细菌集中补充喂养。使用NA22细菌播种。为了使集中补充喂养，GRO细菌瓦特至少四个升NA22在LB培养基中16-24小时。自旋向下，除去上清液，并在100毫升M9的缓冲液中重悬细菌。 200〜400毫升的这种浓缩的细菌溶液可能需要为每个虫种。贮存于4℃ 5 X-大板块开始蠕虫文化。蠕虫生长板约3〜4代，直到妊娠成人。应加入浓缩细菌板，以防止饥饿，必要时（〜1毫升/板材和更换前盖完全干燥）。 妊娠雌雄同体洗净关闭板与M9的缓冲区，并收集在50毫升锥形聚丙烯管的蠕虫。 允许妊娠雌雄同体“，以稳定的底部（约3-5分钟）。去除上清液，包括细菌，卵，幼虫阶段蠕虫。重悬在15毫升M9的缓冲区，轻轻混匀。 蠕虫病毒悬液转移200微升每个60种子NGM板。分散在整个板块的蠕虫。保持蠕虫溶液混合板，直到所有被播种，以确保他们收到的蠕虫病毒的数量大致相等。 补充急需的（〜1 ml/plate/12至24小时内），以防止饥饿的浓缩细菌。允许盖更换前板风干。 2-4代的种植蠕虫，取决于种子蠕虫原来的号码，或直到板妊娠成人。 收获虫板应变时间。洗净蠕虫断板M9的缓冲区，并收集在50毫升聚丙烯管（ 如 6管）。使用M9的缓冲区去洗了个板，然后蠕虫填充缓冲区转移到下一盘。洗涤板数（ 如 10 日 ）后，转移到50毫升管的蠕虫填充的缓冲区。 M9的缓冲区填充管顶端。重复洗涤板的其余部分。 随着妊娠的成年人稳定的底部在5-6分钟，取出上清液（约35毫升），并整合成一个或两个管。填充管50毫升FRESH M9缓冲液，静置3-5分钟，除去上清液离开妊娠大人。重复3次，或者，直到上清液是透明的。 使用大口径巴斯德吸管，转让，许多蠕虫尽可能到两个15毫升聚丙烯锥形管。降速在1000 RCF（〜3,500 rpm时在CentraSL2），在临床离心5分钟。删除的上清和重复，直到所有的蠕虫被转让而在同一管沉淀。在-80℃下尽可能和存储蠕虫尽可能多的上清液中除去重复所有菌株。 2。前列腺素的提取提取所需的试剂如下所示。该方法被修改的17 Golovko和Murphy，包括丙酮提取，然后通过液-液纯化，从而提高LC-MS/MS灵敏度。子弹搅拌机均质，虽然在过程中使用了类似的结果可以得到一个Dounce匀浆。叔丁基hydroxytolue的NE甲苯（BHT）和氮（N 2）下蒸发气体用于防止氧化。所有的玻璃器皿应硅化（Sigmacote）减少脂质结合。用有机溶剂提取应进行化学罩。 称取50毫升的聚丙烯锥形管。约6.0克冷冻蠕虫传输储存在-80℃下用热刀片附近的6.5毫升管贯穿从15毫升锥形管。可以使用的甲醇清洗刮勺以除去冷冻蠕虫颗粒从管的底部。通过切割通过沉淀的颗粒从顶部检索下部，密度较小的幼虫蠕虫和残留的细菌被留了下来。 将预先称重的50毫升锥形管冷冻蠕虫。如果正在处理多个样品，使用相同的金额（6.0克）的组织进行比较研究。由于蠕虫解冻成糊状，添加或删除蠕虫用锅铲，以获得所需的质量。可选：广告D 1.00纳克PGF2α-D4标准，作为内部控制的提取效率。 0.005％BHT蠕虫病毒悬液中加入12毫升冰冷的2:1丙酮/盐水拌匀涡旋。蜗杆淤浆的1.5毫升的分液各12 5毫升自站立在子弹搅拌机用于塑料管。 添加0.7-0.8毫升0.5毫米直径的二氧化铈稳定的氧化锆珠，每次5毫升管。关闭帽紧紧加载12管子弹搅拌机均质。搅拌机运行速度8-9的3分钟，然后把试管放在冰。请务必关闭镜头盖得很紧或内容可能洒出。从一个管检查10微升匀浆幻灯片上使用立体。应该很少有剩余的完整的蠕虫。重复一分钟以相同的速度，如果必要的。 匀浆均匀地转移到四个10毫升锥形玻璃管使用9“巴斯德吸管避免传输珠子。清洗珠三管塞克ntially用1毫升1:2的丙酮/盐水含有BHT。其他管重复清洗，直到所有的珠子。传输剩余的溶液（〜4ml）中的10毫升玻璃试管中，并将其放置在冰上。 在临床离心在约1,000 xg离心10分钟，在4℃下离心10毫升的玻璃管。从每管将上清液转移到一个干净的10毫升玻璃锥形管。 在化学罩中，加入等体积的己烷，每次10毫升玻璃管。例如，添加3.5毫升丙酮/生理盐水溶液3.5 mL正己烷。以最大速度为30秒的涡流。 在临床离心在约1,000 xg离心10分钟，在4℃下离心10毫升的玻璃管。丢弃上相，含有正己烷和中性电荷的脂质。 酸化的下层相pH值至3.5，使用2 M甲酸（约100 – 150微升）。测试pH值用pH条。 在每个试管中加入等体积的氯仿。涡最大速度为30秒，离心管在4°C INA临床离心机〜1,000 XG 10分钟。 取出并丢弃上层水相。插入吸头通过任何残留的乳白色相间低级氯仿相，避免相间。收集下层相从4管中的每一个到一个干净的15毫升锥形玻璃管。在-20℃下放置至少24小时的孵育。在这一点上，其提取物可在-20℃下储存最多两个星期。 以提取从冰箱中拿出，并丢弃其余的乳白色的水，如果目前顶层。氯仿相转移到聚四氟乙烯内衬标记的半德拉姆玻璃瓶采用了全新的巴斯德吸管。在化学罩，蒸发至干，将氯仿可溶组分下一个温柔流动的N 2气。将干燥的提取物可以储存在-20℃下长达2周。 PG提取和分析用于图1中所示的总体方案。 3。前列腺素分析准备股票单独的参考，如前列腺素，前列腺素F2α或PGF 2α-d4上（1微克/毫升）的甲醇稀释，用甲醇：水（8:2体积/体积），以获得一个有效的解决方案的解决方案。准备了一系列的稀释液（100，10，1，0.1，0.01毫微克/毫升），以生成标准曲线。 加入200微升甲醇：水（8:2体积/体积）C.干燥线虫脂质提取物（s）和调匀。如果小于6克蠕虫组织萃取，干燥的萃取物，再悬浮于甲醇：水溶液的量也少。 准备流动相为0.1％甲酸的水[A]和含0.1％甲酸乙腈[B]。 设置自动进样器在4℃，并在70支1.5毫升瓶架放置样品瓶。 平衡协同水力RP-C18柱，0.1％甲酸水溶液，流速为0.2毫升/分钟约5分钟。 入柱中注入样品（20〜50微升）。进行梯度洗脱启动使用10％B，去从0-11分钟11-14分钟80-100％B从80％B，返回到10％B在16分钟。总运行时间为20分钟。 13个标准品的保留时间，如表1所示，在参考文献3。 介绍污水进入质谱仪使用负离子模式的的ESI接口工作在列。使用氮气作为雾化器，气帘气（CUR = 10）。碰撞气体，碰撞能量和温度都设定为10，-35 eV和600℃。去聚势（DP），碰撞能量（CE），池出口处电位（CXP），分别设定为-90，-35和-10。 对于调查扫描（Q1的扫描），使用负离子模式下，对于大多数的PG（ 图2）的质量范围内的m / z 315-360。可以改变的范围内，这取决于化合物的质量（次）的利益。提取离子总离子流（TIC）的LC-MS离子色谱，并决定是否提取TED离子对应去质子化或加合物离子或碎片离子。 对于MRM实验，大规模过渡的m / z三百一十一分之三百五十五的是，用于检测F1级的m / z一百九十三分之三百五十三用于F2类， 米/ z为 351/193或一百九十一分之三百五十一用于F3类（ 图3）。 MRM的，也可用于检测内标（例如， 米/ Z197分之357的PGF2α-d4上），并生成标准曲线。 Murphy 等附加信息PG质量转换18。 对于MS / MS实验中，使用M / Z 355 F1级，M / Z的 F2 353for类和m / z 351for F3级的PG。C.线虫为F系列前列腺素的MS / MS数据，是可在图4和表2 3,16。 MS / MS数据的哺乳动物类二十烷酸是提供www.lipidmaps.org 。 处理分析数据分析产品吨软件（1.4.2版，应用生物系统公司）。

Representative Results

样品制备进行了改编自Golovko和墨菲17液-液萃取。它提供了出色的内部标准（PGF2αD4）恢复。从C PG提取的总体方案图1所示的线虫 。色谱条件进行了优化，提供> 30类花生酸的标准（ 表1显示了13个标准）的基线分离。水力RP柱（250×2.0 mm内径）含0.1％甲酸的水和乙腈提供了最好的分离和灵敏度。调查突变提取野生型和脂肪3所示图2笔全球级离子扫描质量范围为315-360个原子质量单位内缺乏20碳不饱和脂肪酸的脂肪（WA22）突变体。 F3类PG是突出。在图3中 ，野生型提取物的MRM分析显示多个PG异构体的F1（ 图3A </stro纳克>）（ 图3B），F2和F3（ 图3C和3D）类。要么两个质量过渡，可以检测F3类的m / z 351/193或M / Z一百九十一分之三百五十一。 CePGF2主要包括的PGF2α对映体。 CePGF1可能是PGF1α或它的对映体。 图4示出了碰撞诱导分解CePGF2（RT = 11.8）相比，PGF2α标准（RT = 11.8）。产物离子细微的差别可能是由于低的丰度CePGF2和合作洗脱化合物中提取。 图1。 C.示意图线虫的 PGS提取和LC-MS分析 。请注意，丙酮/盐水和氯仿0.005％BHT，以尽量减少脂质氧化。有关详细信息，请参阅文本。https://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig1large.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看大图。 图2。 M / Z 315-360野生型和突变体的脂肪-3（WA22）提取。液相色谱保留时间（RT）的调查扫描显示面板上的[A]。提取离子RT = 11.3显示野生型[B]的脂肪-3（WA22）[C]提取。 PG质量的m / z 351的F3类被高亮显示。 CPS，计数/秒;阿木，原子质量单位。 无花果由图3。 MRM分析野生型的提取物。F1级的PG检测与质量过渡的m / z 355/311 [A]。请注意，一些疏水性化合物（RT> 14分钟），这是不太可能的PG，也检测到这种过渡。 F2类前列腺素检测与群众过渡的m / z 353/193 [B]。 F3类前列腺素的检测为质量过渡的m / z193分之351[C] 或 m / Z191分之351[D]。请注意，提取液中含有多个PG的每个类的同分异构体。数字对应于表2中所示的前列腺素。 CePGF2的浓度是1.8毫微克/毫升。 RT，滞留时间; CPS，计数/秒。 图4。碰撞诱导分解的化学合成esized PGF2α和CePGF2的在面板上的箭头[A]表示PGF2α和CePGF2的（RT = 11.8）之间共享的产品或碎片离子。的商品在M / Z = 309 和 m / z为 193的离子产生的指示的裂解位点（突出显示的a和 b），对应于所示的结构，特征F系列的PG [B]。 CPS，计数/秒。 点击这里查看大图 。 标准 RT（分钟） [MH] – M / Z 主要产品离子MS / MS 20 -羟基PGE 2的 9.43 367 349，331，287，234，189，129，109 </tr> PGF 3 – 11.26 351 333，307，289，271，245，219，209，193，191，171，165，111 血栓素B2 11.66 369 289，191，177，169，151 PGF 2 – 11.80 353 335，309，291，273，263，247，235，209，193，171，165，111 PGF 1 – 11.79 355 319311 337，301，293，275，265，237，211，195 脂氧素B 4 12.38 351 201，191189，165，155，115，107，71，59 PGD ​​2 12.56 351 315 271203 189 5（S），6 -脂氧素A 4（R） 12.83 351 235，217，189，144，135，115，99，59 PGA 2 14.02 333 315，297，271，235，191，189，175，163，137，113，109 Δ12-PGJ 2 14.20 333 271，189，123 白三烯B 4 14.73 335 181，109，93，71，69，59，57 15D-Δ12,14-PGJ 2 16.80 315 297，271，217，203，158 5（S）-HPETE 17.88 335 97，83，81，57 表1中。保留时间和13类花生酸LC-MS/MS方法 3 标准的主要产物离子 。 超过30标准，使用发展LC-MS/MS程序的。不同的色谱保留时间（RT），即使在非常相似的前列腺素。一个例外是PGF1α和PGF2α。然而，这些PGS的istinguished通过母离子的质量（[MH] – M / Z）和碰撞诱导分解光谱（MS / MS）。 前列腺素类 在图3中的编号 [MH] – M / Z 主要产品离子MS / MS F1（CePGF1） 1 355 319，301，311，293，275，265，237，223，211，195，157 F1 2 355 311，301，293，275，265，211，195，167，157 F2（CePGF2） 3 353 309，291，273，263，247，209，193，171，165，127 F2 4 353 309，291，273，263，255，247，219，209，193，171，113 F3 5 351 315，307，289，275，249，205，193，191，167，153，139 F3 6 351 333，289，271，261，245，223，193，191，163 表2中。几个主要C.碰撞诱导分解产物离子线虫 F1，F2，和F3的PG如图3所示 。其他较丰富的异构体的MS / MS将不会显示。这些数据是从多个分析，并非所有产品离子可能会看到在给定运行。鉴于提取物的复杂性，一些不太丰富的产品离子可能来自另一名家长离子具有类似的保留时间或结果的干扰。峰2是有可能的立体异构体CePGF1，峰4是有可能的立体异构体CePGF2。埃德蒙兹等人 （2010年），其他数据3。

Discussion

我们描述了一个程序类花生酸的提取和分析，重点对F系列的PG。有几个部分的程序，可能会产生问题。首先，重要的是该蠕虫的文化不挨饿，饥饿可以改变PG代谢。对于补充喂养，NA22细菌的建议，而不是更常用的OP50细菌，因为NA22达到更高的密度。然而，NA22菌株缺乏抗生素的耐药性，更容易受到污染。其次，蠕虫个人PG异构体合成，低丰度相对哺乳动物组织。这可能是部分原因是由于众多的异构体之间的冗余。我们建议约6克组织进行全面的分析和更强的信号。可以使用，如果较少的组织（1-2克）的干燥的萃取物再悬浮在更短的甲醇：水的溶液，以增加PG浓度。但是，只有一到两个注射剂可以被执行。我们的LC-MS/MS系统的检出限约10皮克_PGF2α/毫升。密密麻麻的混合阶段蠕虫毫升（约1克）产生大约25-50皮克CePGF2。更敏感的质谱系统，可以减少分析所需的蜗杆组织的量。第三，样品PG提取效率之间的差异可以导致不同的结果。我们已经发现，提取效率是非常类似的，当组织中提取平行。要确定效率，加1.0纳克的_{PGF2α-D 4}日作为内部控制的同质化步骤。 MRM 的m / z 357/197用于测量前列腺素_F2α-d4上的浓度，相对于1 ng / ml的标准溶液，使用大量过渡。在提取过程中丢失的_{PGF2α-d 4}中的量，然后计算。

可以改变的色谱参数和质量转变，我们包括检测其他的前列腺素和花生四烯酸。尽管有相当大的努力，我们一直无法识别D系列或E-SERIES PGS提取物中^17。此外，我们并没有发现8 -异前列腺素_F2α，8 -异PGE _2的自由基引发的过氧化反应，生成PG的立体异构体¹⁹是一种非选择性的混合物的特征。不知道是否蠕虫其他类型的PG合成。在C中已发现的内源性大麻素和各种环氧基和羟基代谢产物花生四烯酸和二十碳五酸线虫提取^5,7,20,21。我们建议使用MRM和MS / MS相比正宗的定性和定量的标准，分别。小说类花生酸类物质，这些分析应结合脂肪的突变体，这是缺乏多不饱和脂肪酸合成酶^22，以及一个功能检测，如果可能的话进行比较研究。分钟蠕虫中存在的多不饱和脂肪酸的数量是足够的PG合成分析脂肪的突变体是一个警告。例如， 脂肪-2（WA17）突变体的D12去饱和酶的活性有少量（野生型的^{22％〜5％），}这些突变体仍能产生前列腺素^6。 脂肪3（WA22）和脂肪-4（WA14），突变体不能合成的PG是来自于花生四烯酸和二十碳五酸¹⁶ 。我们还发现， 脂肪的突变体通过上调PG合成的多不饱和脂肪酸类的损失，其余类补偿。例如，的脂肪-3（WA22）突变体没有大多数来自20个碳的多不饱和脂肪酸的PG的合成。相反，他们似乎上调小说PGS来自18碳不饱和脂肪酸^16。到今天为止，我们还没有确定C.线虫应变PG的合成，是完全缺乏。这是可能的，前列腺素是必不可少的生长或发展。

Materials

			REAGENTS
X-large (16 cm) plates	Fisher Scientific	0875714
E. coli strain NA22	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	NA22	http://www.cgc.cbs.umn.edu
Acetone, 399.5%	Fisher Scientific	A928-4
Butylated Hydroxytoluene	MP Biomedicals	101162
Hexane, HPLC grade	Fisher Scientific	H302-1
Formic acid, 399%	Acros	AC27048-0010	Available through Fisher Scientific
Chloroform, HPLC grade	Acros	AC26832-0010	Available through Fisher Scientific
PGF2α-d4	Cayman Chemicals	316010	Cayman has a wide array of standards available for purchase
Sterile screw cap self-standing 5 ml tube	Fisher Scientific	14-222-651	For use with Bullet Blender
0.5 mm zirconium oxide beads	Next >>> Advance	ZrOB05
10 ml glass conical heavy-duty graduated centrifuge tubes	Kimble Kimax	45200-10	Available through Fisher Scientific
15 ml glass conical tubes	Corning Pyrex	8082-15	Available through Fisher Scientific
Sigmacote (Siliconizing reagent)	Sigma-Aldrich	SL2-100ML
Teflon lined capped 1/2 Dram glass vial	Fisher Scientific	V1235C-TFE
			EQUIPMENT
CentraSL2 Clinical Centrifuge	Thomas Scientific	2517N92-TS
Bullet Blender 5 blue homogenizer	Next >>> Advance	BBY5MB	A 40 ml Dounce homogenizer can be used as an alternative
Synergi 4 μm Hydro-RP 80 Å LC Column 250 x 2.0 mm	Phenomenenex	00G-4375-B0	HPLC Column
SecurityGuard Cartridges AQ C18 4 x 2.0 mm	Phenomenenex	AJ0-7510
SecurityGuard Guard Cartridges Kit	Phenomenenex	KJ0-4282
Shimadzu Prominence HPLC with refrigerated auto sampler	Shimadzu Scientific Instruments, Inc.		Any standard HPLC system coupled to a triple quadrupole mass spectrometer should be sufficient
API 4000 triple quadrupole mass spectrometer	Applied Biosystems/MDS SCIEX
			M9 buffer recipe (4 liter) 12 g KH2PO4 24 g Na2HPO4 20 g NaCl Up to 4 liter Deionized water Aliquot to eight 1 liter bottles. Autoclave and cool. 0.5 ml/bottle 1 M MgSO4