שיטות ליצירת רקמות גידול 3D אדם כמערכות בדיקה מתוארות. טכנולוגיות אלה מבוססות על ביולוגי vascularized פיגום decellularized (BioVaSc), תאים אנושיים יסודיים ושורת תאים סרטניים, אשר יכול להיות מתורבת תחת סטטי, כמו גם בתנאים דינאמיים בזרימת bioreactor.
סרטן הוא אחד הגורמים המובילים למוות בכל עולם. אסטרטגיות טיפוליות הנוכחיות בעיקר מפותחות במערכות תרבות 2D, המשקפות כהלכה תנאים פיסיולוגיים בגוף חי. מטריצות 3D ביולוגיות לספק תאי סביבה שבה תאים יכולים לארגן עצמיים, המאפשרת המחקר של ארגון רקמה והתמיינות תאים. ניתן זורעים פיגומים כגון בתערובת סוגי תאים שונים כדי ללמוד תאי תאי אינטראקציות-3D ישירים של. כדי לחקות את מורכבות 3D של גידולי סרטן, הקבוצה שלנו פיתחה מערכת בדיקה 3D במבחנה גידול.
המודלים שלנו 3D מערכת בדיקת רקמות מצב in vivo של גידולים ממאירים היקפיים עצבים נדן (MPNSTs), שהקמנו עם הקטע שלנו decellularized חזירי jejunal פיגום ביולוגי הנגזר vascularized (BioVaSc). במודל שלנו, אנו reseeded מטריצת BioVaSc שונה עם fibroblasts הראשוני, תאי אנדותל כלי הדם (mvECs) ושורת התאים הסרטני S462. לתרבות סטטי, מבנה כלי הדם של BioVaSc מוסר והפיגום שנותר הוא לחתוך פתוח בצד אחד (מעי הדק submucosa SIS-MUC). מטריקס וכתוצאה מכך הוא קבוע אז בין שתי טבעות מתכת (כתרי תא).
אפשרות נוספת היא תרבות תאי זרע SIS-MUC במערכת bioreactor תזרים החושפת את התאים למאמץ גזירה. הנה, bioreactor מחובר למשאבת peristaltic בחממה הוקם באופן עצמי. מחשב מווסת את חמצן העורקים ואספקה של חומר מזין באמצעות פרמטרים כגון לחץ דם, טמפרטורה וקצב זרימה. התקנה זו מאפשרת לתרבות דינמית עם או pulsatile מוסדר לחץ או זרימה קבועה.
במחקר זה, אנו יכולים לקבוע בהצלחה גם מערכת תרבות 3D סטטי ודינמית לMPNSTs. היכולת למודל גידולים סרטניים בסביבת 3D טבעית יותר תאפשר גילוי, בדיקות, ואימות שלתרופות עתידיות במודל דמוי אדם.
תרופות חדשות חייבת להיות מאומתות בכל קשור לאיכותם, בטיחות ויעילות לפני אישור שוק. עד כה, ניסויים בבעלי החיים הם השיטה סטנדרטית לבדיקות סמים ואימות. עם זאת, בשל הבדלי מינים ספציפיים, ניסויים בבעלי החיים לעתים קרובות לא באופן מקיף להעריך את ההשפעה של התרכובות בבני האדם 1. מסיבה זו, חשוב לייצר דגמי רקמה אנושיים שיכול לשמש לבדיקות במבחנה של תרופות וחומרים חדשים.
אחד המוקדים של הקבוצה שלנו הוא היצירה של במבחנה מודלים בדיקה עם הפיגום הביולוגי שלנו vascularized (BioVaSc) 2,3. BioVaSc יכול לשמש כמערכת מטריצת 3D סטטי או דינמית. לתרבות סטטי, מגזר jejunal חזירי decellularized (מעי הדק submucosa SIS-MUC) ממוקם בהוספת מתכת לזריעה מחודשת של תאים. תאים שונים, כגון סרטן ותאי האנדותל יכולים להיות מתורבת על הפיגום.
<pclass = "jove_content"> לתרבות דינמית, BioVaSc מחובר למערכת bioreactor שחלה לאורך זרימה בכלי הדם או על פני השטח של הפיגום. bioreactors הנוכחית ליישם גירויים ביולוגיים, מכאניים, או חשמליים הפועלים על הבידול או התפשטות של תאים 4. לbioreactors בתחום הנדסת רקמות, הרעיון הבסיסי הוא לדמות את התנאים בגוף האדם. שבו, תאים ניתנים סביבה טבעית שבה הם יכולים לתקשר אחד עם השני והמטריצה תאית המקיפה אותם. לייצור במבחנה מערכות בדיקה או השתלות, היכולת לחקות את הסביבה הטבעית של תאים במערכת bioreactor מבנה מנשא מתאים והיא 5 קריטיים. לכן, מכשירים מורכבים יותר ותובעניים מבחינה טכנית יש לפתח כדי למלא משימות אלה 6.זה יתר על כן ניתן להשתמש בפיגום שלנו לestablishment של מודל vascularized בשל המבנים צינוריים השתמרו, הכוללים את עורק ההאכלה, וריד, ומיטת נימים המקשרת. כל התאים החזיריים צריכים להסיר על ידי decellularization הכימי, מכאני והאנזימטית, ומעוקר גמא הפיגום. לאחר מכן ניתן יהיה reseeded מבני כלי דם צינורי המשוחזר עם תאי אנדותל כלי הדם אנושיים באמצעות bioreactor סחרור זלוף 7, אשר מחקה את הפרמטרים ביומכנית ו / או ביוכימיים כגון pH, טמפרטורה, לחץ, אספקת חומרי מזון ופינוי פסולת 6. מחדש endothelialization של המבנים צינורי יוצר מקבילה כלי דם אנושית בתוך 3,7 פיגום collagenous. בשלב הבא, את פני השטח של לומן לשעבר (הרירי) ניתן נזרעו עם תאים אנושיים ראשוניים להקמת שיתוף תרבויות 3,7,8.
במחקר זה מערכת בדיקת גידול 3D מוגדרת על ידי שיתוף culturing שורת תאים סרטניים עם st העיקריתאי רומאל בתנאים סטטיים ודינמיים על SIS-MUC.
כאשר משווה בין מערכות תרבות 2D and 3D במחקר גידול, מערכות 3D, למרות היותו הגישה יקרה יותר, הוכיחו לחקות את התנאים במייקר ביולוגי טובים יותר. זה יכול להיות הראה כי חלק מהתאים סרטניים לגדול הרבה יותר איטיים בתרבות 3D מאשר בתרבות משותפת 2D 12, אשר היא בהתאם למצב בגידול אמיתי. ביסל ועמיתים לעבודה הראו בעבודתם כי התנהגותם של תאי שד מסרטנים משקפת את המצב in vivo, כוללים מורפולוגיה תא ואיתות, בצורה מדויקת יותר, כאשר תרבות 3D בתוך מטריצה מציעה תא אינטראקציות-ECM. יתר על כן, הם הדגישו את חשיבותה של הסביבה תאית ב-3D על ידי הוכחת כי שינויים באינטראקציות הסביבתיות הובילו להחזרה של התאים הממאירים לפנוטיפ נורמלי. בנוסף והכי חשוב, יכולים להיות גם אישרו בתוצאות אלה במודלים של בעלי החיים vivo 10,11.
ontent "> ההשוואה הישירה של in vivo ניסויים בבעלי חיים ובדגמי רקמת מבחנה מגלה יתרונות וחסרונות בשתי המערכות. אחד יתרונות של במבחנה מודלים הוא ברשות הרבה יותר טוב בזמן אמת או הדמיה קבועה על ידי מיקרוסקופ. הגבלה היא כי הם מחקים את תנאים לטווח קצר או סטטי, ואילו בvivo מערכות לעתים קרובות התקדמות. חוסר הנוכחי של כלי דם והובלה תקינה של מולקולות קטנות, תארח את תגובה חיסונית, ותאי תאי אינטראקציות אחרות חסרונות נוספים של במבחנה מודלים 12. לכן, 3D במערכות חוץ גופית כפי שהוצגו במחקר זה מציע תוספת מבטיחה לניסויים בבעלי חיים. הם מספקים השוואה טובה יותר לאורגניזם האנושי ולכן למזער פרשנויות מוטעות ניסיוניות. Biomimetic במערכות מודל vivo יהיה מכאן הפך רלוונטי יותר כדי ללמוד איך סרטן והתפשטות גרורה הוא תלוי בתנאי microenvironmental המסדירים tumorigenesis 11.המחקר שלנו מראה כי סביבת 3D הניתנת על ידי SIS-MUC מובילה להיווצרות יותר כמו גידול רקמות של תאים, אשר לא נצפתה בתרבית תאי 2D הנפוצה (ראה איור 3 א). יתר על כן, השימוש בתאים ראשוניים הנגזרים מביופסיות גידול הוא צעד מאוד חשוב לקראת רפואה אישית, משמעת שמטרתו לזהות את הטיפול הטוב ביותר בהתאם לצרכים האישיים של מטופל. שילוב תאי גידול ראשוני מטופל ספציפי מבודדים מחומר הביופסיה יאפשר בבדיקות במבחנה של אסטרטגיות טיפוליות. מערכות בדיקה מסוג זה תאפשר לחקור תרופות ושילובים שונים ממנו בזמן ותפוקה גבוהה הקרנה לחיסכון בעלויות. בנוסף, השילוב של תאי סטרומה גידולים הקשורים כפי שמוצגים במחקר זה חשוב לגישה אישית, שכן התקדמות גידול השפעות microenvironment של גידול 13 ועשויה להתברר כsuitabיעד טיפולי le.
לחלופין לגישה אישית, מודל הגידול שלנו יכול להיות שונה כדי לשמש כמערכת בדיקת גידול כללית על ידי השילוב של שורות תאים סרטניות שהוקמו. זוהי הסתגלות מבטיחה למטרות מחקר בסיסיות. עבור שני בדיקות הסמים מתקרב לנוכחות של מבנה כלי דם נדרשת כדי לבחון את ההתפלגות וספיגה של חומרים טיפוליים. מטריקס SIS-MUC מאפשר זריעת basolateral עם mvEC העיקרי ללימודי ספיגת מכשול, הזריעה המחודשת של מבני כלי הדם נשמרו של BioVaSc תהיה לשפר עוד יותר את המחקר של אספקת סמים.
על מנת ליצור מודלים רקמות, מטריקס מתכלה 3D יכול לשמש כמסגרת לשיתוף תרבות תאים מסוגים שונים 14. השימוש במטריצות 3D כזה הוא מוגבל לעתים קרובות על ידי היעדר כלי דם תפקודי. בעיה זו ניתן לפתור על ידי השימוש בBioVaSc, המציע str כלי דם נשמרuctures, אשר ניתן reseeded עם תאי האנדותל. יתר על כן, BioVaSc מספק רכיבים תאיים, אשר להבטיח את ההידבקות של התאים ולאפשר בידול רקמות. הוא גם מאפשר את תפקוד הרקמות ספציפי זמן הארוך של רקמות 3D bioartificial 7,8,15. תנאי מוקדם להנדסה של כלי דם תחליפים פונקציונליים הוא החיקוי של פיסיולוגי אנושיים ותנאים ביומכנית. לכן, מערכות bioreactor, אשר יכולה ליישם את הדרישות הללו במבחנה, הן עניין קיצוני ליצירת מודלים גידול ביולוגיים.
השילוב של BioVaSc, טכנולוגית bioreactor ושיתוף תא culturing-סוגים שונים של שיטה מבטיחה מאוד ליצירת רקמות גידול vascularized, אשר תאפשר את המחקר של מנגנונים רלוונטיים להתקדמות סרטן כגון אנגיוגנזה וגרורות. אנו רואים גידול מודלים כגון גישה מבטיחה למשלימים מחקרים בבעלי חיים על ידי מתן שווה ערךלפיסיולוגיה של הגידול האנושי.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מבקשים להודות ליאן Hansmann (Fraunhofer IGB, שטוטגרט) לתמיכה הטכנית שלו לפתח bioreactors וחממת bioreactor.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Collagenase solution | SERVA | 17454 | (500 U/ml) |
Dispase solution | Gibco | 17105-041 | (2.0 U/ml) |
DMEM, high-glucose | PAA | G0001,3010 | |
DNase | ROCHE | 10104159001 | 200 mg solved in 500 ml PBS+ + 1% PenStrep |
DZ solution | Roth | 3484.2 | 34 g Sodium Desoxychelate, in 1 L Ultra-pure water |
FCS | LONZA | DE14-801F | |
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
medical pressure transducer | MEMSCAP | SP844 | |
monoclonal mouse anti-human Von Willebrand Factor | DAKO Cytomation | M0616 | Clone F8/86 0.12 μg/ml |
mouse monoclonal anti-human p53 | DAKO Cytomation | IS616 | Clone DO-7 ready-to-use |
peristaltic pump | Ismatec | ||
sterile disposable dome | MEMSCAP | 844-28 | |
Trypsin / EDTA solution | PAA | L11-003 | 0,05% |
VascuLife (VEGF-Mv) | Lifeline | LL-0003 | |
Versene | Gibco | 15040-033 |