ग्लाइकोजन की बायोकेमिकल अनुमापन<em> इन विट्रो</em
Summary
हम यहाँ इन विट्रो में ग्लाइकोजन का अनुमापन के लिए एक सटीक, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और सुविधाजनक जैव रासायनिक विधि का वर्णन. इस तकनीक Abcam ग्लाइकोजन परख किट का उपयोग करता है और प्रतिदीप्ति द्वारा अनुमापन ग्लूकोज और ग्लूकोज को ग्लाइकोजन की लगातार हाइड्रोलिसिस पर आधारित है.
Abstract
ग्लाइकोजन हड्डीवाला जानवरों में ग्लूकोज का मुख्य ऊर्जावान बहुलक है और एक महत्वपूर्ण पूरे शरीर के चयापचय में भूमिका के साथ ही सेलुलर चयापचय में खेलता है. ग्लाइकोजन का पता लगाने के लिए कई तरीकों पहले से ही मौजूद हैं, लेकिन केवल कुछ ही मात्रात्मक हैं. हम यहाँ glucoamylase द्वारा ग्लूकोज में ग्लाइकोजन के विशिष्ट गिरावट पर आधारित है जो Abcam ग्लाइकोजन परख किट का उपयोग कर एक विधि का वर्णन. ग्लूकोज तो विशेष रूप से प्रतिदीप्ति निर्माण करने के लिए OxiRed जांच के साथ प्रतिक्रिया करता है कि एक उत्पाद ऑक्सीकरण हो जाता है. अनुमापन, सही संवेदनशील है और सेल के अर्क या ऊतक वर्गों पर प्राप्त किया जा सकता है. हालांकि, अन्य तकनीकों के विपरीत, यह सेल में ग्लाइकोजन के वितरण के बारे में जानकारी देना नहीं है. इस तकनीक का एक उदाहरण के रूप में, हम normoxia में incubated दो सेल लाइनों, चीनी हैम्स्टर फेफड़ों fibroblast CCL39 और मानव बृहदान्त्र कार्सिनोमा LS174, हाइपोक्सिया बनाम (21% ओ 2) (1% 2 हे) में यहां ग्लाइकोजन का अनुमापन का वर्णन. हम हाइपोक्सिया एक हस्ताक्षर है कि धारणाएनएएल कि कोशिकाओं 1 जीवित रहने के लिए synthesize और दुकान ग्लाइकोजन के लिए तैयार करता है.
Introduction
ग्लाइकोजन कई प्रकार की कोशिकाओं की कोशिका द्रव्य में मौजूद है जो ग्लूकोज अवशेषों का एक multibranched बहुलक, है. यह कोशिकाओं में ऊर्जा भंडारण के मुख्य रूपों में से एक है और ग्लूकोज चयापचय में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. सबसे स्तनधारी कोशिकाओं के तेजी से चयापचय तनाव के दौरान ग्लाइकोलाइसिस और एटीपी उत्पादन को बढ़ावा देने के लिए ग्लूकोज में अपमानित किया जा सकता है और दुकान ग्लाइकोजन, उत्पादन करने में सक्षम हैं. Hepatocytes जिससे शरीर को ग्लूकोज की एक सतत आपूर्ति प्रदान करने के लिए रक्त शर्करा के स्तर को विनियमित करने के लिए ग्लाइकोजन का भारी मात्रा में उत्पादन. इसके विपरीत, अन्य कोशिकाओं (मांसपेशियों, लाल रक्त कोशिकाओं, आदि) में ग्लाइकोजन की एकाग्रता अपेक्षाकृत कम है. हालांकि, स्थानीय स्तर पर, इन मात्रा में कोशिकाओं अचानक पोषक तत्वों से वंचित एक वातावरण के संपर्क में हैं जब अल्पकालिक में ऊर्जा प्रदान करने के लिए पर्याप्त हैं.
ग्लाइकोजन संश्लेषण और ग्लाइकोजन टूटने सभी ऊतकों में एक ही कदम (चित्रा 1) इस प्रकार है. सबसे पहले, ग्लूकोजग्लूकोज ट्रांसपोर्टरों (gluts) द्वारा कोशिकाओं में प्रवेश करती है, और तेजी से phosphoglucomutase द्वारा ग्लूकोज-1-फॉस्फेट (G1P) में ग्लूकोज 6 फॉस्फेट (G6P) से बदल जाती है. G1P तो यूडीपी ग्लूकोज में परिवर्तित हो जाता है, और यूडीपी ग्लूकोज की कार्बन सी 1 glycogenin, ग्लाइकोजन की एंकरिंग प्रोटीन की एक tyrosine अवशेषों से जुड़ा हुआ है. इस अणु, एक ग्लाइकोजन प्राइमर माना, ग्लाइकोजन synthase के माध्यम से एक α (1 → 4) बंधन से टर्मिनल ग्लूकोज को यूडीपी ग्लूकोज की कुर्की के लिए बढ़ा दी है. 11 से अधिक ग्लूकोज अवशेषों की एक रेखीय श्रृंखला बनाई है अंत में, जब शाखाओं में एंजाइम पास एक α (1 → 6) लिंकेज के माध्यम से श्रृंखला की एक और ग्लूकोज को 6 ग्लूकोज अवशेषों की एक न्यूनतम द्वारा गठित एक टर्मिनल oligosaccharide स्थानान्तरण. इस प्रक्रिया की पुनरावृत्ति बारी प्रति 6.5 ग्लूकोज के साथ एक हेलिक्स कि शाखाओं से युक्त एक विशाल भग्न संरचना देता है. ग्लाइकोजन ठोस कार्रवाई से ग्लूकोज के विपरीत hydrolyzed हो सकता हैएक शाखा के ग्लूकोज के अंतिम अवशेषों और ग्लाइकोजन अणु के बीच बाध्य glycosidic α (1 → 4) hydrolyzes कि α (1 → 6) ही है और ग्लाइकोजन phosphorylase hydrolyze एंजाइमों कि debranching की. Glycogenolysis नामक यह प्रतिक्रिया (एटीपी खपत को दर्शाती) एएमपी के स्तर में वृद्धि से सक्रिय है, और ग्लूकोज और एटीपी 2,3 से हिचकते हैं.
इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा, ग्लाइकोजन अणुओं कई प्रकार की कोशिकाओं व्यास में 15-30 एनएम के रूप में β मुक्त कण (या ग्लाइकोजन monoparticles) में वर्णित किया गया है. ऐसे hepatocytes के रूप में विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं में, β कणों 80 एनएम से 200 एनएम 4 की एक अधिकतम करने के लिए व्यास में भिन्नता भी है कि α कणों के रूप में जाना जाता rosettes, फार्म करने के लिए एक परिसर में इकट्ठा किया जा सकता है </समर्थन>. इन β कणों α कणों के बड़े समूहों के लिए फार्म बंधुआ रहे हैं जिस तरह से अभी भी पूरी तरह से स्पष्ट नहीं है. कुछ सबूत β कणों सहसंयोजक संबंध 5, हाइड्रोजन संबंध, या यहां तक कि प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत से 6 से बंधुआ किया जा सकता है साबित करने के लिए जाता है. कोशिकाओं में संग्रहित ग्लाइकोजन की राशि कई मापदंडों पर निर्भर करता है: (मैं) ग्लाइकोजन संश्लेषण शुरू की है कि सेल में glycogenin की राशि, प्रोटीन phosphorylation / dephosphorylation द्वारा विनियमित ग्लाइकोजन synthase और phosphorylase (ii) गतिविधि, (iii) एकाग्रता ऐसे नाड़ी तंत्र से ग्लूकोज की आपूर्ति और कोशिकाओं द्वारा ग्लूकोज तेज के रूप में कई मापदंडों पर निर्भर है जो कोशिकाओं में ग्लूकोज की. ग्लाइकोजन भंडार कसकर ऊर्जा चयापचय को विनियमित हार्मोन द्वारा, मध्यवर्ती मेटाबोलाइट्स के माध्यम से biosynthetic हार्मोन की allosteric विनियमन द्वारा विनियमित, और पोषक तत्व संवेदन संकेत दे रास्ते 7 से कर रहे हैं.
यह होना ज़रूरी हैबेहतर पूरे शरीर और सेलुलर स्तर पर ग्लाइकोजन चयापचय के महत्व को समझने के लिए जैविक नमूने में ग्लाइकोजन यों के लिए सक्षम. हम यहाँ ग्लाइकोजन के लिए इन विट्रो परख में एक, सटीक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और सुविधाजनक जैव रासायनिक वर्णन. इस तकनीक को ग्लाइकोजन के विशिष्ट हाइड्रोलिसिस पहले और बाद में मात्रा का ठहराव ग्लूकोज प्रतिदीप्ति पर आधारित है.
अन्य तरीकों कोशिकाओं में ग्लाइकोजन के स्तर का अनुमान मौजूद हैं, लेकिन उनमें से ज्यादातर मात्रात्मक नहीं हैं. कोशिकाओं में ग्लाइकोजन की मात्रा का ठहराव के लिए वर्णित पहले तकनीकों में से एक ग्लाइकोजन 8,9 में [14 सी] ग्लूकोज समावेश के माप के आधार पर किया गया था. रेडियोधर्मिता का उपयोग संभाल करने के लिए इस प्रक्रिया को और अधिक कठिन बना देता है, लेकिन यह ग्लाइकोजन में और बाहरी शाखाओं पर और अणु के मूल में ग्लूकोज के अवशेष के वितरण के बीच भेद में ग्लूकोज समावेश की दर प्रदान करने का लाभ दिया है (यह भी एक आवश्यकता है अतिरिक्त β-amylolyबहन और एक chromatographic कदम). एक और तकनीक को और अधिक हाल ही में विकसित किया गया था और 2 NBDG के समावेश पर आधारित है (2 – {एन [7-nitrobenz-2-oxa-1 ,3-diazol-4-YL] अमीनो}-2-deoxyglucose), एक ग्लाइकोजन 10 में 2-deoxyglucose फ्लोरोसेंट व्युत्पन्न,. मापा प्रतिदीप्ति तीव्रता का उत्पादन ग्लाइकोजन की मात्रा को दर्शाता है और एक प्रतिदीप्ति पाठक के साथ मापा जा सकता है. सेल में प्रतिदीप्ति का वितरण भी confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है.
अन्य nonquantitative तकनीक के अलावा, आवधिक एसिड-Schiff धुंधला (पीए) शायद सबसे आम है. यह तय कोशिकाओं, आयल में ऊतक वर्गों या फ्रोजन में ग्लाइकोजन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. बैंगनी में इस ऊतकीय तकनीक रंगों गैर विशेष रूप से polysaccharides, glycolipids, ग्लाइकोप्रोटीन, सेल्यूलोज और तटस्थ mucins. इस परीक्षण की विशिष्टता विशेष रूप से ग्लाइकोजन हज़म जो डायस्टेज, साथ तय कोशिकाओं या ऊतक वर्गों के उपचार के द्वारा बढ़ाया जा सकता है. इसके बाद,ग्लाइकोजन के स्तर में गुणात्मक (कार्बोहाइड्रेट ग्लाइकोजन छोड़कर बड़े अणुओं संशोधित) हाइड्रोलाइज्ड नमूने के unhydrolyzed नमूने (सभी कार्बोहाइड्रेट संशोधित अणुओं) की तुलना द्वारा अनुमान लगाया जा सकता है. ग्लाइकोजन के जैव रासायनिक assays के विपरीत पीए धुंधला और सूक्ष्म विश्लेषण, दूर तक फैला हुआ या सेल के एक खास हिस्से में केंद्रित किया जा सकता है जो सेल में ग्लाइकोजन के वितरण के विषय में जानकारी प्रदान करता है. यहां तक कि विभिन्न स्थितियों के बीच ग्लाइकोजन संचय में पीए धुंधला अनुमानों मतभेद हालांकि, हालांकि, यह 11 मात्रात्मक नहीं है.
एक मोनोक्लोनल माउस एंटीबॉडी मूल रूप से प्रतिजन विट्रो 12 में कोशिकाओं में ग्लाइकोजन के साथ और शुद्ध ग्लाइकोजन के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए दिखाया गया है के रूप में जबड़े वाहकनलिका उपास्थि का उपयोग किया. इस एंटीबॉडी विशेष रूप से ग्लाइकोजन से संबंधित चीनी श्रृंखला पहचानता है, यह पीए धुंधला की तुलना में एक अधिक विशिष्ट तरीके से immunohistochemistry द्वारा ग्लाइकोजन का पता लगाने के लिए एक उपयोगी उपकरण है. </p>
इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी कोशिकाओं और ग्लाइकोजन भंडारण की डिग्री के मूल्यांकन में ग्लाइकोजन के अनाज के दृश्य की अनुमति देता है कि एक और तकनीक है. वास्तव में, ग्लाइकोजन β कणों इलेक्ट्रान घने कणिकाओं 1 के रूप में एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ आसानी से पहचानने योग्य होते हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
इन विट्रो में ग्लाइकोजन की बायोकेमिकल अनुमापन कोशिकाओं ग्लाइकोजन सामग्री का सही मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है. कुछ अन्य तकनीकों (एक ग्लाइकोजन एंटीबॉडी के साथ पीए, immunofluorescence, आदि.) के मुकाबले इस …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम हमें प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करने की अनुमति के लिए और उनकी मदद के लिए डॉ. थियरी Pourcher के लिए आभारी हैं. प्रयोगशाला लीग नेशनल Contre ले कैंसर (Equipe labellisée) द्वारा वित्त पोषित है, एसोसिएशन ला Recherche contre Le कैंसर, Institut राष्ट्रीय du कैंसर (इंका) बहना, एजेंस नेशनल ला Recherche, METOXIA (ईयू कार्यक्रम FP7), केंद्र डालना ए Lacassagne, केंद्र में राष्ट्रीय डी ला Recherche Scientifique, Institut राष्ट्रीय डे ला Sante एट डी ला Recherche médicale और अच्छा विश्वविद्यालय ( http://www.unice.fr/isdbc/ ). हम महत्वपूर्ण पढ़ने और संपादकीय सुधार के लिए डॉ. एम क्रिस्टियन Brahimi हॉर्न धन्यवाद.
Materials
| REAGENTS | |||
| DMEM | Invitrogen | 31966.047 | |
| Glycogen Assay Kit | Abcam | ab65620 | |
| PBS | |||
| EQUIPMENT | |||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Fluorescence Spectrometer | PerkinElmer | LS 50B |
Referências
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