Titulação Bioquímica de glicogênio<em> In vitro</em
Summary
Descrevemos aqui um método bioquímico exato, reprodutível e conveniente para a titulação de glicogênio in vitro. Esta técnica utiliza o kit de ensaio Abcam do glicogénio e é baseado na hidrólise sucessiva de glicogênio a glicose e glicose titulação por fluorescência.
Abstract
Glicogénio é o principal polímero energético de glicose em animais vertebrados e desempenha um papel fundamental no metabolismo de todo o corpo bem como no metabolismo celular. Já existem muitos métodos para detectar o glicogênio, mas apenas alguns são quantitativos. Descrevemos aqui um método que utiliza o kit de ensaio Abcam do glicogénio, que é baseada na degradação específica de glicogênio a glicose por glucoamilase. A glicose é oxidada então especificamente a um produto que reage com a sonda OxiRed para produzir fluorescência. Titulação é preciso, sensível e pode ser alcançado em extratos de células ou secções de tecidos. No entanto, em contraste com outras técnicas, que não dá informação sobre a distribuição de glicogénio na célula. Como um exemplo desta técnica, descrevemos aqui a titulação de glicogénio em duas linhas celulares de fibroblastos, chinês CCL39 de pulmão de hamster e humanas LS174 carcinoma do cólon, incubadas em normoxia (21% de O 2) contra a hipoxia (1% de O2). Nossa hipótese é que a hipóxia é um signal que prepara as células para sintetizar e armazenamento de glicogénio, a fim de sobreviver 1.
Introduction
Glicogénio é um polímero de múltiplas ramificações de resíduos de glicose, que está presente no citoplasma de muitos tipos de células. É uma das principais formas de armazenamento de energia nas células e desempenha um papel importante no metabolismo da glicose. A maioria das células de mamíferos são capazes de produzir e armazenar glicogênio, que pode ser rapidamente degradado em glicose para promover a glicólise e ATP produção durante o estresse metabólico. Hepatócitos produzir grandes quantidades de glicogénio para regular o nível de açúcar no sangue, proporcionando assim um fornecimento contínuo de glicose no corpo. Em contraste, a concentração de glicogénio nos músculos (outras células, as células vermelhas do sangue, etc) é relativamente baixa. No entanto, a nível local, estas quantidades são suficientes para fornecer energia a curto prazo quando as células são repentinamente expostos a um ambiente privado de nutrientes.
A síntese de glicogénio e a quebra de glicogênio segue os mesmos passos em todos os tecidos (Figura 1). Em primeiro lugar, a glucoseentra nas células por transportadores de glicose (GLUTs), e é rapidamente convertido a partir de glicose-6-fosfato (G6P) em glicose-1-fosfato (G1P) por fosfoglucomutase. G1P é então modificada em UDP-glucose, e o carbono C1 da UDP-glucose é ligado a um resíduo de tirosina de glicogenina, a proteína de ancoragem de glicogénio. Esta molécula, considerada um iniciador de glicogénio, é alargada por fixação da UDP-glucose para o terminal de glicose por uma α (1 → 4) ligação através da sintase do glicogénio. Finalmente, quando uma cadeia linear de mais de 11 resíduos de glicose é formada, a enzima de ramificação transfere um oligossacárido de terminal constituída por um mínimo de 6 resíduos de glicose para outro glicose de cadeia vizinha através de uma α (1 → 6) de ligação. A repetição desse processo dá uma enorme estrutura fractal contendo ramos que formam uma hélice com 6,5 glicose por turno. O glicogênio pode ser inversamente hidrolisada em glicose pela ação concertadadesramificadora de enzimas que hidrolisam o α (1 → 6) amarrado e glicogênio fosforilase que hidrolisa o α (1 → 4) glicosídica limite entre o último resíduo de glicose de um ramo ea molécula de glicogênio. Esta reação chamado glicogenólise é ativado, aumentando os níveis de AMP (refletindo o consumo de ATP) e inibida por glicose e ATP 2,3.
Por microscopia electrónica, as moléculas de glicogénio tem sido descrito em muitos tipos de células como as partículas β livres (ou monoparticles glicogênio) de 15-30 nm de diâmetro. Em tipos de células específicas, tais como os hepatócitos, partículas β pode ser montado em um complexo para formar rosetas, também conhecidas como partículas α que variam em diâmetro de 80 nm, com um máximo de 200 nm, 4 </sup>. A forma como estas partículas β estão ligados para formar grandes aglomerados de partículas α ainda não está completamente elucidado. Algumas evidências tende a demonstrar que as partículas β podem ser ligados por uma ligação covalente 5, ligações de hidrogénio, ou até mesmo através de interacções proteína-proteína 6. A quantidade de glicogénio armazenado nas células depende de vários parâmetros: (i) a quantidade de glicogenina na célula que inicia a síntese de glicogénio, (II), a actividade de sintase do glicogénio fosforilase e regulada por fosforilação da proteína / desfosforilação, (III) a concentração de glicose nas células, o que é dependente de vários parâmetros, tais como o fornecimento de glucose a partir do sistema vascular e a absorção de glicose pelas células. Os estoques de glicogênio estão fortemente regulada por regulação alostérica de hormônios biossintéticas através metabólitos intermediários, por hormônios que regulam o metabolismo energético e de nutrientes por sensoriamento vias de sinalização 7.
É importante estarcapazes de quantificar de glicogénio em amostras biológicas para compreender melhor a importância do metabolismo do glicogénio em todo o corpo e nível celular. Descrevemos aqui um bioquímico preciso, reprodutível e conveniente ensaio in vitro para glicogênio. Esta técnica baseia-se na quantificação de fluorescência de glicose antes e depois da hidrólise específica de glicogénio.
Existem outros métodos para a estimativa do nível de glicogénio nas células, mas a maioria deles não são quantitativas. Uma das primeiras técnicas descritas para a quantificação de glicogénio nas células foi baseada na medição da incorporação de [14 C]-glucose em glicogénio 8,9. O uso de radioactividade torna este processo mais difícil de manusear, mas tem a vantagem de fornecer a taxa de incorporação de glucose em glicogénio e para distinguir entre a distribuição dos resíduos de glicose nos ramos exteriores e no núcleo da molécula (isto também requer um β-amyloly adicionalsis e uma etapa de cromatografia). Outra técnica foi desenvolvido mais recentemente e baseia-se na incorporação de 2-NBDG (2 – {N-[7-nitrobenz-2-oxa-1 ,3-diazol-4-il] amino}-2-desoxiglucose), um 2-desoxiglucose derivado fluorescente, em glicogênio 10. A intensidade de fluorescência medida reflecte a quantidade de glicogénio produzido e pode ser medida com um leitor de fluorescência. Distribuição de fluorescência na célula também pode ser avaliada por microscopia confocal.
Entre as outras técnicas não quantitativa, ácido periódico de Schiff (PAS) é talvez a mais comum. Ele pode ser usado para a detecção de glicogénio em células fixadas, as secções de tecido em parafina ou congelado. Estas cores técnica histológica não especificamente polissacarídeos, glicolipídeos, glicoproteínas, celulose e mucinas neutras em roxo. A especificidade deste ensaio pode ser aumentada por tratamento de células ou secções de tecido fixadas com diastase, que digere especificamente glicogénio. Posteriormente,o nível de glicogênio pode ser qualitativamente estimada comparando amostras não hidrolisados (todas as macromoléculas de carboidratos modificados) para amostras hidrolisadas (carboidrato macromoléculas modificado, exceto glicogênio). Coloração com PAS e análise microscópica, ao contrário de ensaios bioquímicos de glicogénio, fornece informação sobre a distribuição de glicogénio na célula, o qual pode ser difuso ou concentrado numa determinada parte da célula. No entanto, embora as diferenças das estimativas de coloração PAS em acúmulo de glicogênio entre diferentes condições, não é quantitativa 11.
Um anticorpo monoclonal de rato originalmente feitas usando cartilagem condilar da mandíbula, o antigénio tem sido demonstrado que reagem com glicogénio em células e com glicogénio purificada in vitro, 12. Como este anticorpo reconhece especificamente cadeias de açúcar relacionados com o glicogénio, que é um instrumento útil para a detecção de glicogénio por imuno-histoquímica de uma forma mais específica do que a coloração PAS. </p>
A microscopia eletrônica é outra técnica que permite a visualização de grãos de glicogênio em células e avaliação do grau de armazenamento de glicogênio. Na verdade, o glicogênio partículas β são facilmente reconhecíveis com um microscópio eletrônico de elétrons como grânulos densos 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Titulação Bioquímica de glicogênio in vitro permite uma quantificação precisa das células conteúdo de glicogênio. Comparando com outras técnicas (PAS, de imunofluorescência com um anticorpo de glicogénio, etc.), Esta titulação é muito específica, sensível e reprodutível. Além disso, o método é conveniente, uma vez que não necessita de radioactividade mas um espectrómetro de fluorescência. No entanto, esta técnica é puramente quantitativa e não fornece informações sobre a di…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos ao Dr. Thierry Pourcher por nos permitir usar o espectrômetro de fluorescência e por sua ajuda. O laboratório é financiado pelo Ligue Nationale Contre le Câncer (équipe labellisée), a Associação pour la Recherche contre le Câncer, o Instituto Nacional do Câncer du (INCA), a Agence Nationale pour la Recherche, METOXIA (programa da UE FP7), o Centro A. Lacassagne, o Centre National de la Recherche Scientifique, o Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale e da Universidade de Nice ( http://www.unice.fr/isdbc/ ). Agradecemos ao Dr. M Christiane Brahimi-Horn para a leitura crítica e correção editorial.
Materials
| REAGENTS | |||
| DMEM | Invitrogen | 31966.047 | |
| Glycogen Assay Kit | Abcam | ab65620 | |
| PBS | |||
| EQUIPMENT | |||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Fluorescence Spectrometer | PerkinElmer | LS 50B |
Referências
- Pelletier, J., et al. Glycogen Synthesis is Induced in Hypoxia by the Hypoxia-Inducible Factor and Promotes Cancer Cell Survival. Front Oncol. 2, (2012).
- Alonso, M. D., Lomako, J., Lomako, W. M., Whelan, W. J. A new look at the biogenesis of glycogen. FASEB J. 9, 1126-1137 (1995).
- Bollen, M., Keppens, S., Stalmans, W. Specific features of glycogen metabolism in the liver. Biochem. J. 336 (Pt 1), 19-31 (1998).
- Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver. Biochem. Biophys. Res. Commun. 362, 811-815 (2007).
- Sullivan, M. A., et al. Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions. Biomacromolecules. 11, 1094-1100 (2010).
- Chee, N. P., Geddes, R. The structure of liver glycogen. FEBS Lett. 73, 164-166 (1977).
- Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes. Biochem. J. 441, 763-787 (2012).
- Moses, S. W., Bashan, N., Gutman, A. Glycogen metabolism in the normal red blood cell. Blood. 40, 836-843 (1972).
- Agbanyo, M., Taylor, N. F. Incorporation of 3-deoxy-3-fluoro-D-glucose into glycogen and trehalose in fat body and flight muscle in Locusta migratoria. Biosci. Rep. 6, 309-316 (1986).
- Louzao, M. C., et al. “Fluorescent glycogen” formation with sensibility for in vivo and in vitro detection. Glycoconj. J. 25, 503-510 (2008).
- Sheehan, D. C. H., B, B. . Theory and practice of histotechnology. , (1980).
- Baba, O. Production of monoclonal antibody that recognizes glycogen and its application for immunohistochemistry. Kokubyo Gakkai Zasshi. 60, 264-287 (1993).
