Биохимический Титрование гликогена<em> В пробирке</em
Summary
Мы описываем здесь точный, воспроизводимый и удобный биохимический метод титрования гликогена в пробирке. Этот метод использует набор для анализа Abcam гликогена и основан на последовательном гидролиза гликогена в глюкозу и глюкозы титрования по флуоресценции.
Abstract
Гликоген является основным энергичный полимер глюкозы в позвоночных животных и играет решающую роль во всей обмен веществ, а также в клеточном метаболизме. Многие методы для обнаружения гликогена уже существуют, но лишь немногие из них количественный. Мы описываем здесь метод, используя набор для анализа Abcam гликогена, который основан на определенной деградации гликогена в глюкозу по глюкоамилазой. Глюкоза затем окисляют в частности к продукту, который реагирует с зондом OxiRed для получения флуоресценции. Титрование является точным, чувствительным и может быть достигнуто на клеточных экстрактов или срезов тканей. Однако, в отличие от других методов, он не дает информацию о распределении гликогена в клетке. В качестве примера этого метода описаны здесь титрование гликогена в двух клеточных линий, китайского хомячка фибробластов легких CCL39 человека и LS174 карциномы толстой кишки, инкубированных в нормоксии (21% O 2) в сравнении с гипоксией (1% O 2). Мы предположили, что гипоксия является сигАнал, что готовит клетки синтезировать и хранить гликоген, чтобы выжить 1.
Introduction
Гликоген multibranched полимер из остатков глюкозы, который присутствует в цитоплазме многих типах клеток. Это один из основных форм накопления энергии в клетках и играет важную роль в метаболизме глюкозы. Большинство клеток млекопитающих способны производить и хранить гликоген, который можно быстро разлагается на глюкозу для продвижения гликолиза и производство АТФ при метаболическом стрессе. Гепатоциты производить огромное количество гликогена регулировать уровень сахара в крови, тем самым, обеспечивая непрерывную подачу глюкозы в организме. В противоположность этому, концентрация гликогена в других клетках (мышцы, клетки крови, и т.д.) является относительно низким. Тем не менее, на местном уровне, эти величины являются достаточными для обеспечения энергии в краткосрочной перспективе, когда клетки вдруг подвергается среде, лишенной питательных веществ.
Синтез гликогена и распад гликогена те же шаги во всех тканях (рис. 1). Во-первых, глюкозапроникает в клетку путем переносчиков глюкозы (излишкам), и быстро превращается из глюкозо-6-фосфата (G6P) в глюкозо-1-фосфата (G1P) по фосфоглюкомутазы. G1P затем модифицируется на UDP-глюкозы, и атом углерода, С1 UDP-глюкозы прикреплен к остатка тирозина, glycogenin анкерного белка гликогена. Эта молекула, считается гликогена грунтовка, продлевается на крепления UDP-глюкозы в терминал глюкозы с помощью α (1 → 4) облигаций через гликогенсинтазы. Наконец, когда линейной цепочки более 11 остатков глюкозы образуется, ветвления фермент передает терминала олигосахарид, образованную как минимум 6 глюкозных остатков глюкозы в другой цепи около через α (1 → 6) связей. Повторение этого процесса дает массивный фрактальной структуры, содержащий ветви, которые образуют спираль с 6,5 глюкозы на очереди. Гликоген может быть обратно гидролизованный до глюкозы согласованных действийиз обрезка сучьев ферменты, которые гидролиза α (1 → 6) связан и гликогенфосфорилазы, что гидролизует α (1 → 4) гликозидную грань между последним остатком глюкозы филиала и молекулы гликогена. Эта реакция называется гликогенолиз активируется за счет увеличения уровня АМФ (отражающие потребление АТФ), и ингибируется глюкозой и АТФ 2,3.
С помощью электронного микроскопа, молекулы гликогена были описаны во многих типах клеток, как β свободных частиц (или гликогена monoparticles) 15-30 нм в диаметре. В конкретных типов клеток, таких как гепатоцитов, β частицы могут быть собраны в комплексе с образованием розетки, также известный как α частиц, которые изменяются в диаметре от 80 нм до не более 200 нм 4 </SUP>. Как эти частицы β присоединены, образуют более крупные кластеры частиц α еще полностью не выяснены. Некоторые данные, как правило, доказать, что β частицы могут быть соединены путем ковалентного связывания 5, водородных связей, или даже через белок-белковых взаимодействий 6. Количество гликогена, запасенного в клетках зависит от многих параметров: (I) количество glycogenin в клетке, который инициирует синтез гликогена; (II) активность гликоген-синтазы и фосфорилазы, регулируемой фосфорилирования белка / дефосфорилирования; (III) концентрация глюкозы в клетках, который зависит от нескольких параметров, таких как поставку глюкозы из сосудистой системы и усвоения глюкозы клетками. Запасы гликогена жестко регулируется аллостерической регуляции биосинтеза гормонов через промежуточные метаболиты, гормонами, регулирующими энергетический обмен, а питательных зондирования сигнальных путей 7.
Важно бытьв состоянии определить количество гликогена в биологических образцах, чтобы лучше понять важность обмена гликогена в всего тела и клеточном уровне. Мы описываем здесь точное, воспроизводимое и удобный биохимические в анализе пробирке для гликогена. Этот метод основан на флуоресценции количественное глюкозы до и после определенного гидролиза гликогена.
Другие методы существуют, чтобы оценить уровень гликогена в клетках, но большинство из них не являются количественными. Одним из первых методов, описанных для количественного определения гликогена в клетках была основана на измерении [14 C]-глюкозы в гликоген включения 8,9. Использование радиоактивности делает этот процесс более сложным делом, но оно имеет преимущество в обеспечении скорости глюкозы в гликоген включения и в различении между распределением остатков глюкозы на внешних ветвей и в сердцевине молекулы (это также требует дополнительная β-amylolyсестра и хроматографический шаг). Другой метод был разработан в последнее время и основан на включении 2-NBDG (2 – {N-[7-nitrobenz-2-окса-1 ,3-тиадиазол-4-ил] амино}-2-дезоксиглюкозы), 2-дезоксиглюкозы люминесцентные производная, в гликоген 10. Измеренная интенсивность флуоресценции отражает количество гликогена, полученный и может быть измерена с читателем флуоресценции. Распределение флуоресценции в клетке также может быть оценена с помощью конфокальной микроскопии.
Среди других неколичественных методов, Периодическая кислота-Шифф окрашивание (PAS) является, пожалуй, наиболее распространенным. Он может быть использован для обнаружения гликогена в фиксированных клеток, тканевых срезов в парафин, либо заморожены. Это гистологические цвета техника, не специально полисахариды, гликолипиды, гликопротеины, целлюлоза и нейтральные муцины в фиолетовый. Специфичность этого теста может быть увеличена путем обработки основных клеток или срезов ткани с диастаза, который специфически переваривает гликоген. После этогоуровень гликогена может быть качественно оценивается путем сравнения негидролизованной образцы (все углеводов изменение макромолекулы) гидролизованными образцов (углеводов изменение макромолекулы кроме гликогена). PAS окрашивания и микроскопический анализ, в отличие от биохимических анализов гликогена, предоставляет информацию о распределении гликогена в клетке, которая может быть рассеянный или сконцентрированных в определенной части клетки. Однако, даже если оценках окрашивания PAS различий в накоплении гликогена между различными условиях, это не количественный 11.
Мышиные моноклональные антитела первоначально с использованием нижнечелюстной мыщелкового хряща в качестве антигена было показано, реагируют с гликогена в клетках и очищенной гликогена в пробирке 12. Как это антитело специфически распознает гликогена, связанных сахарных цепей, это является полезным инструментом для выявления гликогена по иммуногистохимии в более конкретном способом, чем окрашивания PAS. </p>
Электронная микроскопия является другая техника, которая позволяет визуализировать зерен гликогена в клетках и оценки степени гликогена. На самом деле, гликогена β частицы легко узнаваемы с электронной микроскопии как электронных плотных гранул 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Биохимический титрование гликогена в пробирке позволяет точно количественное клеток гликогена содержания. По сравнению с некоторыми другими методами (PAS, иммунофлюоресценции с гликогена антитела, и т.д..), Это титрования очень специфичен, чувствителен и воспроизводимым. Кром…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны доктору Тьерри Pourcher за предоставленную нам возможность использовать флуоресцентный спектрометр и за его помощь. Лаборатория финансируется Ligue Nationale Contre ле рака (Моя команда labellisée), Ассоциация Pour La Recherche Контр ле рака, Национальный институт дю Рак (Inca), Национальное агентство по Pour La Recherche, METOXIA (программа ЕС FP7), Центр А. Lacassagne, Национальный центр Научных Исследований, Национальный институт де-ла-Здоровье и де ла Recherche Médicale и Университета Ниццы ( http://www.unice.fr/isdbc/ ). Мы благодарим доктора M Кристиан Брахими-рог для критического чтения и редакционной коррекции.
Materials
| REAGENTS | |||
| DMEM | Invitrogen | 31966.047 | |
| Glycogen Assay Kit | Abcam | ab65620 | |
| PBS | |||
| EQUIPMENT | |||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Fluorescence Spectrometer | PerkinElmer | LS 50B |
Referências
- Pelletier, J., et al. Glycogen Synthesis is Induced in Hypoxia by the Hypoxia-Inducible Factor and Promotes Cancer Cell Survival. Front Oncol. 2, (2012).
- Alonso, M. D., Lomako, J., Lomako, W. M., Whelan, W. J. A new look at the biogenesis of glycogen. FASEB J. 9, 1126-1137 (1995).
- Bollen, M., Keppens, S., Stalmans, W. Specific features of glycogen metabolism in the liver. Biochem. J. 336 (Pt 1), 19-31 (1998).
- Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver. Biochem. Biophys. Res. Commun. 362, 811-815 (2007).
- Sullivan, M. A., et al. Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions. Biomacromolecules. 11, 1094-1100 (2010).
- Chee, N. P., Geddes, R. The structure of liver glycogen. FEBS Lett. 73, 164-166 (1977).
- Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes. Biochem. J. 441, 763-787 (2012).
- Moses, S. W., Bashan, N., Gutman, A. Glycogen metabolism in the normal red blood cell. Blood. 40, 836-843 (1972).
- Agbanyo, M., Taylor, N. F. Incorporation of 3-deoxy-3-fluoro-D-glucose into glycogen and trehalose in fat body and flight muscle in Locusta migratoria. Biosci. Rep. 6, 309-316 (1986).
- Louzao, M. C., et al. “Fluorescent glycogen” formation with sensibility for in vivo and in vitro detection. Glycoconj. J. 25, 503-510 (2008).
- Sheehan, D. C. H., B, B. . Theory and practice of histotechnology. , (1980).
- Baba, O. Production of monoclonal antibody that recognizes glycogen and its application for immunohistochemistry. Kokubyo Gakkai Zasshi. 60, 264-287 (1993).
