En Isoleret Semi-intakt Forberedelse af Mouse vestibulære Sensory epitel for Elektrofysiologi og høj opløsning To-foton mikroskopi
Summary
Analyse af vestibulære hår celle funktion kompliceres af deres placering dybt inde den sværeste del af kraniet, den petrous tindingebenet. De fleste funktionelle hår celle undersøgelser har brugt akut isolerede hårceller. Her beskriver vi en semi-intakt forberedelse af muse vestibulære epitel for elektrofysiologiske og to-foton mikroskopi studier.
Abstract
Forståelse vestibulære hårceller fungerer under normale forhold, eller hvordan traumer, sygdom og aldring forstyrre denne funktion er et afgørende skridt i udviklingen af forebyggende tiltag og / eller nye terapeutiske strategier. Imidlertid har de fleste af undersøgelserne ser på unormal vestibulære funktion ikke været på celleniveau, men primært fokuseret på adfærdsmæssige analyser af vestibulære dysfunktion såsom gangart analyser og vestibulo-okular refleks ydeevne. Mens dette arbejde har givet værdifulde data om, hvad der sker, når tingene går galt, er lidt information udledes om de underliggende årsager til dysfunktion. Af de undersøgelser, der fokuserer på cellulære og subcellulære processer, der ligger til grund for vestibulære funktion, har de fleste påberåbt akut isolerede hårceller, blottet for deres synaptiske forbindelser og støtte celle miljø. Derfor har en stor teknisk udfordring været adgang til de udsøgt følsomme vestibulære hårceller i et prepredelsen, der er mindst forstyrret, fysiologisk. Her viser vi en semi-intakt forberedelse af muse vestibulære sensoriske epithel, der bevarer det lokale mikro-miljø, herunder hår celler / primære afferente komplekser.
Introduction
På trods af den betydelige bidrag vestibulære system i vores hverdag, er fortsat en klar forståelse af de processer, der er ansvarlige for det konstaterede fald i vestibulære funktion med alderen undvigende. En af grundene til denne mangel på viden er, at faldet i vestibulære funktion er næsten udelukkende blevet undersøgt ved hjælp af adfærdsmæssige assays, herunder vestibulo-okulære refleks (VOR), en præcis indikator for ydre vestibulære funktion, men giver begrænsede indsigt i de ændringer af interne komponenter . Dette er en væsentlig hindring for vores forståelse af vestibulære hår celle funktion i sundhed, sygdom eller aldring.
Mens der har været mange undersøgelser af individuelle vestibulære hårceller, har en stor mangel været afhængighed af akutte hår cellepræparationer, hvor hårceller og endda baegerblade afferente terminaler fjernet fra deres normale miljø via mekanisk og / eller enzymatisk behandling. Sådanne tilgange inevitaligt forstyrre den fine mikroarkitektur mellem hår celle og blomsterbægeret, og hår celle og støtte celle. Med udviklingen af semi-intakte præparater 1-5, og en isoleret mus labyrint forberedelse 6, er der nu en mulighed for at undersøge de forskellige former for synaptisk kommunikation under forhold, som i højere grad ligner dem in vivo. Faktisk viste Lim et al. (2011) markante forskelle i helcelle strømninger optaget fra akut isolerede type I vestibulære hårceller i forhold til dem, der forblev indlejret i neuroepithelium. Specifikt kalium menes at akkumulere i det intercellulære rum mellem håret celle og blomsterbægeret afferent og væsentligt ændre hår celle respons 7.. Denne type oplysninger ville være umuligt at opnå uden den semi-intakte forberedelse af vestibulære sensoriske epithel beskrevet her. Vi viser den semi-intakte forberedelse af muse crista 3, Og viser repræsentative resultater opnået fra helcelle-patch elektrofysiologi, og to-foton calcium imaging.
Protocol
Representative Results
Discussion
De mekanismer, der ligger til grund vores følelse af balance har fået begrænset opmærksomhed i sammenligning med andre sansesystemer, fx visuelle og auditive systemer. Af de undersøgelser, der har undersøgt ændringer i vestibulære eller balance funktion, har de fleste fokuseret på adfærdsmæssige foranstaltninger, herunder vestibulo-okulær refleks, med ufuldstændig viden om de grundlæggende byggesten for betalingsbalancestatistik, det vestibulære hårceller selv. Disse undersøgelser, der har konc…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansieringen af dette arbejde blev leveret af en Garnett Passe og Rodney Williams Memorial Foundation Project tilskud til R. Lim og AJ Camp.
Materials
| REAGENTS | |||
| Leibovitz medium L-15 | Sigma Aldrich | L4386-10X1L | |
| BAPTA-1-oregon green | Invitrogen | O6806 | |
| EQUIPMENT | |||
| Stereo microscope | Leica Microsystems | A60S | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Two-photon microscope | Olympus/La Vision | BX51WI/ TriMScope II | |
| Dumont #5 SF Forceps | FST | 11252-00 | |
| Friedman-Pearson Rongeurs | FST | 16221-14 | |
| Standard Pattern Scissors | FST | 14001-12 | |
| InstraTECH A-D converter | HEKA | ITC-18 | |
| Sutter Micromanipulator | Sutter | MP-225/M | |
| multiclamp amplifier | Axon Instruments | 700B | |
| Data acquisition software (electrophysiology) | Axograph | N/A | |
| Imspector Data acquisition software (two-photon) | Max Planck innovation | N/A |
Referências
- Dulon, D., Safieddine, S., Jones, S. M., Petit, C. Otoferlin is critical for a highly sensitive and linear calcium-dependent exocytosis at vestibular hair cell ribbon synapses. J. Neurosci. 29, 10474-10487 (2009).
- Highstein, S., Art, J., Holstein, G., Rabbitt, R. Simultaneous pre- and post-synaptic recording from the peripheral vestibular calyx and its included type I hair cell. , (2009).
- Kindig, A. E., Lim, R., Callister, R. J., Brichta, A. M. Voltage dependent currents in type I and II hair cell and calyx terminals of primary afferents in an intact in vitro mouse vestibular crista preparation. , (2009).
- Chatlani, S., Goldberg, J. M. Whole-cell recordings from calyx endings in the turtle posterior crista. , (2010).
- Songer, J. E., Eatock, R. A. Transduction in the mammalian saccule. , (2010).
- Lee, H. Y., Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Vestibular primary afferent activity in an in vitro preparation of the mouse inner ear. J. Neurosci. Methods. 145, 73-87 (2005).
- Lim, R., Kindig, A. E., Donne, S. W., Callister, R. J., Brichta, A. M. Potassium accumulation between type I hair cells and calyx terminals in mouse crista. Exp. Brain Res. 210, 607-621 (2011).
- Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Inhibitory synaptic transmission differs in mouse type A and B medial vestibular nucleus neurons in vitro. J. Neurophysiol. 95, 3208-3218 (2006).
- Camp, A. J., et al. Attenuated glycine receptor function reduces excitability of mouse medial vestibular nucleus neurons. Neurociência. 170, 348-360 (2010).
- Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. J. Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).
- Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471, 183-188 (2011).
- Rennie, K. J., Streeter, M. A. Voltage-dependent currents in isolated vestibular afferent calyx terminals. J. Neurophysiol. 95, 26-32 (2006).
- Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana. J. Physiol. 400, 237-274 (1988).
- Rennie, K. J., Ashmore, J. F. Ionic currents in isolated vestibular hair cells from the guinea-pig crista ampullaris. Hear. Res. 51, 279-291 (1991).
