Un isolato semi-intatte Preparazione del mouse vestibolare epitelio sensoriale di Elettrofisiologia e ad alta risoluzione microscopia a due fotoni
Summary
Analisi della funzione delle cellule dei capelli vestibolare è complicata dalla loro posizione in profondità all'interno della parte più dura del cranio, l'osso temporale petroso. La maggior parte dei studi sulle cellule dei capelli funzionali hanno usato acutamente cellule ciliate isolate. Qui si descrive una preparazione semi-intatte di topo epitelio vestibolare per studi di microscopia elettrofisiologici e due fotoni.
Abstract
Comprendere le cellule ciliate vestibolari funzionano in condizioni normali, o come un trauma, malattia, invecchiamento e interrompere questa funzione è un passo fondamentale per lo sviluppo di approcci di prevenzione e / o di nuove strategie terapeutiche. Tuttavia, la maggior parte degli studi che stanno visualizzando funzione vestibolare anormale non sono stati a livello cellulare, ma si è concentrata principalmente sulle analisi comportamentali della disfunzione vestibolare, come le analisi del cammino e le prestazioni riflesso vestibolo-oculare. Anche se questo lavoro ha prodotto dati importanti su ciò che accade quando le cose vanno male, poca informazione viene estratta per quanto riguarda le cause di disfunzione. Tra gli studi che si concentrano sui processi cellulari e sub-cellulari che sono alla base la funzione vestibolare, la maggior parte hanno fatto affidamento su cellule ciliate acutamente isolati, privi delle loro connessioni sinaptiche e l'ambiente delle cellule di sostegno. Pertanto, una sfida tecnica è stata accesso alle cellule ciliate vestibolari squisitamente sensibili in un prepparazione che è meno perturbato, fisiologicamente. Qui mostriamo una preparazione semi-intatto del mouse vestibolare epitelio sensoriale che mantiene il micro-ambiente locale tra cui cellule capelli / complessi afferenti primari.
Introduction
Nonostante il significativo contributo del sistema vestibolare per la nostra vita di tutti i giorni, una chiara comprensione dei processi responsabili del declino osservato in funzione vestibolare con l'età rimane elusiva. Uno dei motivi di questa mancanza di conoscenza è che il declino della funzione vestibolare è quasi esclusivamente stata esplorata mediante saggi comportamentali, tra cui il riflesso vestibolo-oculare (VOR), un indicatore preciso della funzione vestibolare estrinseca, ma offre spunti limitati nei cambi di componenti intrinseche . Questo è uno dei principali ostacoli per la nostra comprensione della funzione delle cellule dei capelli vestibolare in salute, la malattia, o l'invecchiamento.
Mentre ci sono stati molti studi di cellule ciliate vestibolari singole, una grave lacuna è stata il ricorso a preparazioni di cellule dei capelli acuti, dove le cellule dei capelli e dei terminali afferenti anche calice vengono rimossi dal loro ambiente normale mediante trattamento meccanico e / o enzimatica. Approcci come inevitaBly disturbare il delicato microarchitettura tra cellule dei capelli e calice, e capelli cellula e cellula di supporto. Con lo sviluppo di preparati semi-intatte 1-5, e un isolato mouse preparazione labirinto 6, ora vi è la possibilità di studiare le varie forme di comunicazione sinaptica in condizioni che avvicinano maggiormente a quelle in vivo. Infatti, (2011) Lim et al. Ha mostrato notevoli differenze nelle correnti cellule intere registrati da tipo acuto isolato I cellule ciliate vestibolari rispetto a quelli che sono rimasti inseriti all'interno del neuroepitelio. Specificamente, potassio è pensato ad accumularsi nello spazio intercellulare, tra la cella capelli e calice afferente, e modifica significativamente capelli risposta cellulare 7. Questo tipo di informazioni sarebbe impossibile da ottenere senza la preparazione semi-intatte dell'epitelio sensoriale vestibolare qui descritto. Dimostriamo la preparazione semi-intatto del mouse crista 3, E mostrare i risultati rappresentativi ottenuti da cellule intere di patch elettrofisiologia e di imaging di calcio a due fotoni.
Protocol
Representative Results
Discussion
I meccanismi alla base il nostro senso di equilibrio hanno ricevuto scarsa attenzione rispetto ad altri sistemi sensoriali, ad esempio, i sistemi visivi e uditivi. Tra gli studi che hanno indagato i cambiamenti nella funzione vestibolare o di equilibrio, la maggior parte sono concentrati su misure comportamentali tra cui il riflesso vestibolo-oculare, con una conoscenza incompleta degli elementi costitutivi fondamentali del-la bilancia cellule ciliate vestibolari stesse. Quegli studi che si sono concentrati sul…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il finanziamento per questo lavoro è stato fornito da un Garnett Passe e Rodney Williams Memorial Foundation sovvenzione di progetto a R. Lim e AJ Campo.
Materials
| REAGENTS | |||
| Leibovitz medium L-15 | Sigma Aldrich | L4386-10X1L | |
| BAPTA-1-oregon green | Invitrogen | O6806 | |
| EQUIPMENT | |||
| Stereo microscope | Leica Microsystems | A60S | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Two-photon microscope | Olympus/La Vision | BX51WI/ TriMScope II | |
| Dumont #5 SF Forceps | FST | 11252-00 | |
| Friedman-Pearson Rongeurs | FST | 16221-14 | |
| Standard Pattern Scissors | FST | 14001-12 | |
| InstraTECH A-D converter | HEKA | ITC-18 | |
| Sutter Micromanipulator | Sutter | MP-225/M | |
| multiclamp amplifier | Axon Instruments | 700B | |
| Data acquisition software (electrophysiology) | Axograph | N/A | |
| Imspector Data acquisition software (two-photon) | Max Planck innovation | N/A |
Referências
- Dulon, D., Safieddine, S., Jones, S. M., Petit, C. Otoferlin is critical for a highly sensitive and linear calcium-dependent exocytosis at vestibular hair cell ribbon synapses. J. Neurosci. 29, 10474-10487 (2009).
- Highstein, S., Art, J., Holstein, G., Rabbitt, R. Simultaneous pre- and post-synaptic recording from the peripheral vestibular calyx and its included type I hair cell. , (2009).
- Kindig, A. E., Lim, R., Callister, R. J., Brichta, A. M. Voltage dependent currents in type I and II hair cell and calyx terminals of primary afferents in an intact in vitro mouse vestibular crista preparation. , (2009).
- Chatlani, S., Goldberg, J. M. Whole-cell recordings from calyx endings in the turtle posterior crista. , (2010).
- Songer, J. E., Eatock, R. A. Transduction in the mammalian saccule. , (2010).
- Lee, H. Y., Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Vestibular primary afferent activity in an in vitro preparation of the mouse inner ear. J. Neurosci. Methods. 145, 73-87 (2005).
- Lim, R., Kindig, A. E., Donne, S. W., Callister, R. J., Brichta, A. M. Potassium accumulation between type I hair cells and calyx terminals in mouse crista. Exp. Brain Res. 210, 607-621 (2011).
- Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Inhibitory synaptic transmission differs in mouse type A and B medial vestibular nucleus neurons in vitro. J. Neurophysiol. 95, 3208-3218 (2006).
- Camp, A. J., et al. Attenuated glycine receptor function reduces excitability of mouse medial vestibular nucleus neurons. Neurociência. 170, 348-360 (2010).
- Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. J. Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).
- Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471, 183-188 (2011).
- Rennie, K. J., Streeter, M. A. Voltage-dependent currents in isolated vestibular afferent calyx terminals. J. Neurophysiol. 95, 26-32 (2006).
- Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana. J. Physiol. 400, 237-274 (1988).
- Rennie, K. J., Ashmore, J. F. Ionic currents in isolated vestibular hair cells from the guinea-pig crista ampullaris. Hear. Res. 51, 279-291 (1991).
