Amélioration de la préparation et la conservation de l'hippocampe Tranches de souris pour un enregistrement très stable et reproductible de potentialisation à long terme
Summary
Cet article présente une méthodologie complète pour préparer et conserver<em> In vitro</em> Coupes d'hippocampe aiguë de souris adultes. Ce protocole permet l'enregistrement de potentialisation à long terme durable très stable (LTP) pendant plus de 8 heures avec un taux de réussite de 95%.
Abstract
Potentialisation à long terme (LTP) est un type de plasticité synaptique caractérisée par une augmentation de la force synaptique et censé être impliqué dans l'encodage de la mémoire. LTP a suscité dans la région CA1 de tranches d'hippocampe aiguë a été largement étudiée. Cependant, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la phase d'entretien de ce phénomène sont encore mal compris. Cela pourrait être dû en partie aux différentes conditions expérimentales utilisées par les différents laboratoires. En effet, la phase de maintien de la LTP est fortement dépendant de paramètres extérieurs tels que l'oxygénation, la température et l'humidité. Il dépend aussi de paramètres internes tels que l'orientation du plan de tranchage et la viabilité de la tranche après dissection.
L'optimisation de tous ces paramètres permet l'induction d'une potentialisation très reproductible et très stable à long terme. Cette méthode offre la possibilité d'explorer plus avant les mécanismes moléculaires impliqués dans l'augmentation stablela force synaptique dans des coupes d'hippocampe. Il souligne également l'importance des conditions expérimentales dans l'investigation in vitro de phénomènes neurophysiologiques.
Introduction
Aujourd'hui, il ya une compréhension limitée de la façon dont les souvenirs complexes sont mémorisés et rappelés au niveau du circuit neuronal. Cependant, une hypothèse unificatrice de stockage de mémoire est disponible et largement acceptée: les souvenirs sont stockés comme des changements dans la force des connexions synaptiques entre les neurones dans le système nerveux central. À elle seule, la recherche sur la plasticité synaptique a largement bénéficié de deux découvertes révolutionnaires. (1) Dans un essai séminal, Bliss et Lomo 1, en utilisant le lapin anesthésié intact, a constaté que la livraison d'une brève haute fréquence (1 sec, 100 Hz) stimulation de la voie perforante de l'hippocampe a provoqué une longue durée (plusieurs heures) augmenter dans les connexions synaptiques liés. Ce phénomène fascinant s'appelait «potentialisation à long terme» ou LTP par Douglas et Goddard en 1975 2. (2) Par la suite, il a été constaté qu'un phénomène similaire pourrait être déclenché dans des tranches de cerveau (0,4 mm) maintenu artificiellement en vie in vitro </em>. La LTP plus étudié a été observée in vitro en fournissant un ou plusieurs tetani à un faisceau d'axones (les soi-disant collatérales de Schaffer) tout en enregistrant le champ excitateur potentiel synaptique résultant évoqué dans les neurones pyramidaux de la région dite CA1. Les mécanismes de LTP induction ont été largement mis en évidence. Fondamentalement, un influx de Ca2 + à travers les récepteurs NMDA active les enzymes avec deux conséquences: une phosphorylation des récepteurs AMPA (ce qui augmente leur efficacité) et une incorporation de récepteurs AMPA supplémentaires dans la membrane post-synaptique 3. En revanche, les mécanismes de la phase de maintien de la LTP sont largement inconnues, notamment parce qu'elle est expérimentalement beaucoup plus difficile de maintenir une tranche santé pendant de nombreuses heures que pendant 30 à 60 min.
Beaucoup d'études ont été consacrées à la compréhension des mécanismes LTP et des théories intéressantes ont été élaborés au cours des années 4-11. Mais l'ONUjusqu'à présent, les mécanismes moléculaires précis qui sous-tendent l'augmentation stable de la force synaptique n'ont pas été élucidées. Cela pourrait être dû en partie à la difficulté de reproduire les résultats précédents dans différents laboratoires utilisant des techniques différentes pour la préparation et l'entretien des coupes d'hippocampe. Dans leur document de méthodologie, le 12 Sajikumar et al. Souligné l'importance des conditions expérimentales pour la préparation de coupes d'hippocampe de rat et l'enregistrement de LTP stable. Dans cette vidéo, nous vous présentons l'ensemble des étapes d'optimisation développés dans notre laboratoire au cours des années pour être en mesure d'enregistrer une LTP très stable dans les tranches d'hippocampe de souris.
Cette optimisation a été faite à partir des protocoles développés et utilisés avec succès par d'autres laboratoires qui étudient les mécanismes LTP chez les souris et les rats 13 11. Il permet aux chercheurs expérimentés pour induire et enregistrent une très longue durée LTP chez des souris adultes avec un taux de réussite élevé. Le physiological base de la LTP induite a été soigneusement vérifié et démontré 14. Dans ce document de méthodologie, nous montrons que les modifications des conditions expérimentales, telles que la température ou l'oxygénation peuvent avoir un impact profond sur l'entretien LTP alors que la procédure de dissection peut profondément modifier tranches excitabilité. Il faut également souligner que le contrôle précis de tous ces paramètres nécessite une formation de plusieurs mois pour les étudiants débutants.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons développé dans notre laboratoire un protocole résultant de la combinaison des méthodes développées et utilisées par d'autres laboratoires ayant une grande expertise dans la LTP enregistrements 11,17. Ce protocole est adapté à l'hippocampe de souris adulte et peut être utilisé chez les animaux de tout âge et de tout génotype de fond. Il permet également l'analyse de LTP dans des souris transgéniques développement des maladies neurodégénératives comme la maladie d'A…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Bernard Foucart pour l'assistance technique. Ce travail a été financé par le Fonds belge de la recherche scientifique (FRS-FNRS) et par le Fonds Reine Elisabeth pour la recherche médicale. Agnès Villers est chercheur au Fonds de la Recherche Scientifique.
Materials
| Reagent/Material | |||
| NaCl | Sigma – Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma – Aldrich | S8875 | |
| KCl | Sigma – Aldrich | P9333 | |
| D-glucose | Sigma – Aldrich | G7528 | |
| NaH2PO4 | Sigma – Aldrich | S9638 | |
| MgSO4 1M | Sigma – Aldrich | 63126 | |
| CaCl2 | Sigma – Aldrich | C4901 | |
| Carbogen | Air Liquide (Belgium) | ||
| Capillaries | WPI, Inc. (UK) | TW150-4 | |
| Stimulating Electrodes | FHC (USA) | CE2B30 | |
| Surgical tools | FST (Germany) | ||
| Filter paper 84 g/m2 | Sartorius | FT-3-105-110 | |
| Mesh | Lycra | 15 den | |
| Glue | UHU | plus endfest300 | |
| Instrument | |||
| Amplifier | WPI, Inc. (UK) | ISO-80 | |
| Interface recording chamber | FST (Germany) | ||
| Peristaltic pumps | Gilson (USA) | Minipuls 3 | |
| Temperature controller | University of Edinburgh | www.etcsystem.com | |
| Tissue Chopper | Mcllwain | ||
| Stimulators | Grass (USA) | S88X + SIU-V | |
| Program analysis | WinLTP | www.winltp.com | |
| Micromanipulators | Narishige | MM-3 and MMO-220A | |
| Surgical microscope | Leica Microsystem | ||
| A/D converter | National Instruments | NIPCI-6229 M-series |
Referências
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