Forbedret forarbejdning og konservering af Hippocampale Mouse Skiver for en meget stabil og reproducerbar optagelse af langfristet Potensering
Summary
Denne artikel præsenterer en komplet metode til at forberede og bevare<em> In vitro</em> Akutte hippocampusskiver fra voksne mus. Denne protokol tillader optagelse af meget stabil langvarig langsigtet potensering (LTP) i mere end 8 timer med en succesrate på 95%.
Abstract
Langsigtet (LTP) er en form for synaptisk plasticitet kendetegnet ved en stigning i synaptisk styrke og menes at være involveret i hukommelsen kodning. LTP fremkaldt i CA1-regionen af akutte hippocampusskiver er blevet grundigt undersøgt. Men de molekylære mekanismer, der ligger vedligeholdelsesfasen af dette fænomen er stadig dårligt forstået. Dette kan til dels skyldes de forskellige eksperimentelle betingelser, der anvendes af forskellige laboratorier. Faktisk vedligeholdelsesfasen af LTP er stærkt afhængig af eksterne parametre som iltning, temperatur og fugtighed. Det er også afhængig af interne parametre som orientering af udskæring flyet og skive levedygtighed efter dissektion.
Optimeringen af alle disse parametre muliggør induktion af en meget reproducerbar og meget stabil langsigtet potensering. Denne metode giver mulighed for yderligere at udforske de molekylære mekanismer, der er involveret i den stabile stigningi synaptisk styrke i hippocampusskiver. Det understreger også betydningen af eksperimentelle forhold i in vitro undersøgelser af neurofysiologiske fænomener.
Introduction
I dag er der begrænset forståelse af, hvordan komplekse erindringer lagres og hentes på den neuronale kredsløb niveau. Men en samlende hypotese hukommelse opbevaring er tilgængelig og bredt accepteret: erindringer lagres som ændringer i styrken af synaptiske forbindelser mellem neuroner i centralnervesystemet. På eget, har forskning i synaptisk plasticitet i høj grad nydt godt af to banebrydende opdagelser. (1) I en skelsættende eksperiment, Bliss og Lomo 1, ved hjælp af intakte bedøvede kanin, fandt, at levering af et kort med høj frekvens (1 sek, 100 Hz) stimulation til perforante sti af hippocampus forårsagede en langvarig (flere timer) stigning i de relaterede synaptiske forbindelser. Denne fascinerende fænomen blev kaldt "langtidspotentiering" eller LTP af Douglas og Goddard i 1975 2.. (2) Senere blev det konstateret, at et lignende fænomen kan udløses i hjernen skiver (0,4 mm) kunstigt opretholdt i live in vitro </em>. Den mest undersøgte LTP blev observeret in vitro ved at levere en eller flere tetani til et bundt af axoner (de såkaldte Schaffer sikkerhedsstillelsen), mens der optages resulterende feltet excitatorisk synaptisk potentiale fremkaldt i de pyramidale neuroner i det såkaldte CA1-region. Mekanismerne i LTP induktion er i vid udstrækning blevet afsløret. Dybest set, en Ca2 +-indstrømning gennem NMDA-receptorerne aktiverer enzymer med to konsekvenser: en phosphorylering af AMPA-receptorer (hvilket øger deres effektivitet) og en inkorporering af ekstra AMPA-receptorer i den postsynaptiske membran 3.. Derimod er mekanismerne i vedligeholdelsesfasen af LTP stort set ukendt, især fordi det er eksperimentelt meget mere vanskeligt at opretholde en skive sundt for mange timer end i 30 til 60 min.
En lang række undersøgelser har været dedikeret til forståelsen af LTP mekanismer og interessante teorier er blevet udarbejdet i løbet af årene 4-11. Men until nu, har de præcise molekylære mekanismer bag den stabile stigning i synaptisk styrke ikke er blevet belyst. Dette kunne til dels skyldes vanskeligheden ved at gengive tidligere resultater i forskellige laboratorier ved hjælp af forskellige teknikker til udarbejdelse og vedligeholdelse af hippocampusskiver. I deres metode papir understregede Sajikumar et al. 12. betydningen af eksperimentelle betingelser for udarbejdelse af rotte hippocampusskiver og registrering af stabile LTP. I denne video præsenterer vi alle optimering trin udviklet i vores laboratorium gennem årene for at kunne optage en meget stabil LTP i muse hippocampusskiver.
Denne optimering er fremstillet af protokoller udviklet og anvendt med succes af andre laboratorier, der studerer LTP mekanismer hos mus 13 og rotter 11.. Det giver erfarne forskere til at inducere og optage en meget langvarig LTP i voksne mus med en høj succesrate. Physiological grundlag af den inducerede LTP blev omhyggeligt kontrolleret og demonstreret 14.. I denne metode papir, viser vi, at eventuelle ændringer af eksperimentelle forhold, såsom temperatur eller iltning kan have en dybtgående indvirkning på LTP vedligeholdelse, mens dissektion procedure dybt kan ændre skiver ophidselse. Det skal også understreges, at den præcise styring af alle disse parametre kræver en uddannelse af flere måneder for nybegyndere studerende.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har udviklet i vores laboratorium en protokol som følge af kombinationen af metoder udviklet og brugt af andre laboratorier, der har en stor ekspertise i LTP optagelser 11,17. Denne protokol er tilpasset voksen mus hippocampus og kan anvendes i dyr af enhver alder og enhver baggrund genotype. Det giver også analyse af LTP i transgene mus udvikler neurodegenerative sygdomme såsom Alzheimers sygdom 18,19.
Udnyttelsen af denne protokol for rotte hippocampusskiv…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Bernard Foucart til teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af den belgiske fond for videnskabelig forskning (FRS-FNRS) og af Dronning Elisabeth fond for Medical Research. Agnès Villers er Research Fellow på den belgiske fond for videnskabelig forskning.
Materials
| Reagent/Material | |||
| NaCl | Sigma – Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma – Aldrich | S8875 | |
| KCl | Sigma – Aldrich | P9333 | |
| D-glucose | Sigma – Aldrich | G7528 | |
| NaH2PO4 | Sigma – Aldrich | S9638 | |
| MgSO4 1M | Sigma – Aldrich | 63126 | |
| CaCl2 | Sigma – Aldrich | C4901 | |
| Carbogen | Air Liquide (Belgium) | ||
| Capillaries | WPI, Inc. (UK) | TW150-4 | |
| Stimulating Electrodes | FHC (USA) | CE2B30 | |
| Surgical tools | FST (Germany) | ||
| Filter paper 84 g/m2 | Sartorius | FT-3-105-110 | |
| Mesh | Lycra | 15 den | |
| Glue | UHU | plus endfest300 | |
| Instrument | |||
| Amplifier | WPI, Inc. (UK) | ISO-80 | |
| Interface recording chamber | FST (Germany) | ||
| Peristaltic pumps | Gilson (USA) | Minipuls 3 | |
| Temperature controller | University of Edinburgh | www.etcsystem.com | |
| Tissue Chopper | Mcllwain | ||
| Stimulators | Grass (USA) | S88X + SIU-V | |
| Program analysis | WinLTP | www.winltp.com | |
| Micromanipulators | Narishige | MM-3 and MMO-220A | |
| Surgical microscope | Leica Microsystem | ||
| A/D converter | National Instruments | NIPCI-6229 M-series |
Referências
- Bliss, T. V., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J. Physiol. 232 (2), 331-356 (1973).
- Douglas, R. M., Goddard, G. V. Long-term potentiation of the perforant path-granule cell synapse in the rat hippocampus. Brain Res. 86, 205-215 (1975).
- Squire, L., Kandel, E. . Memory: From mind to molecules. , (1999).
- Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP. Science. 265 (5175), 1104-1107 (1994).
- Frey, U., Morris, R. G. Synaptic tagging and long-term potentiation. Nature. 385 (6616), 533-536 (1038).
- Bortolotto, Z. A., Collingridge, G. L. A role for protein kinase C in a form of metaplasticity that regulates the induction of long-term potentiation at CA1 synapses of the adult rat hippocampus. Eur. J. Neurosci. 12 (11), 4055-4062 (2000).
- Migues, P. V., Hardt, O., et al. PKMzeta maintains memories by regulating GluR2-dependent AMPA receptor trafficking. Nat. Neurosci. 13 (5), 630-634 (2010).
- Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. -. C., Choquet, D. Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity. Neuron. 54 (3), 447-460 (2007).
- Vickers, C. A., Dickson, K. S., Wyllie, D. J. A. Induction and maintenance of late-phase long-term potentiation in isolated dendrites of rat hippocampal CA1 pyramidal neurones. J. Physiol. 568 (3), 803-813 (2005).
- Fonseca, R. Activity-dependent actin dynamics are required for the maintenance of long-term plasticity and for synaptic capture. Eur. J. Neurosci. 35 (2), 195-206 (2012).
- Redondo, R. L., Okuno, H., Spooner, P. A., Frenguelli, B. G., Bito, H., Morris, R. G. M. Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation. J. Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).
- Sajikumar, S., Navakkode, S., Frey, J. U. Protein synthesis-dependent long-term functional plasticity: methods and techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 15 (5), 607-613 (2005).
- Connor, S. A., Wang, Y. T., Nguyen, P. V. Activation of beta-adrenergic receptors facilitates heterosynaptic translation-dependent long-term potentiation. J. Physiol. 589 (17), 4321-4340 (2011).
- Villers, A., Godaux, E., Ris, L. Long-lasting LTP requires neither repeated trains for its induction nor protein synthesis for its development. PLoS One. 7 (7), e40823 (2012).
- Capron, B., Sindic, C., Godaux, E., Ris, L. The characteristics of LTP induced in hippocampal slices are dependent on slice-recovery conditions. Learn. Mem. 13 (3), 271-277 (2006).
- Villers, A., Godaux, E., Ris, L. Late phase of L-LTP elicited in isolated CA1 dendrites cannot be transferred by synaptic capture. Neuroreport. 21, 210-215 (2010).
- Nguyen, P. V., Kandel, E. R. Brief theta-burst stimulation induces a transcription-dependent late phase of LTP requiring cAMP in area CA1 of the mouse hippocampus. Learn. Mem. 4 (2), 230-243 (1997).
- Dewachter, I., Ris, L., et al. Modulation of synaptic plasticity and Tau phosphorylation by wild-type and mutant presenilin1. Neurobiol. Aging. 29 (5), 639-652 (2008).
- Dewachter, I., Filipkowski, R. K., et al. Deregulation of NMDA-receptor function and down-stream signaling in APP[V717I] transgenic mice. Neurobiol. Aging. 30 (2), 241-256 (2009).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology. J. Vis. Exp. (49), e2330 (2011).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J. Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).
- Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity. Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).
- Alger, B. E., Dhanjal, S. S., Dingledine, R., Garthwaite, J., Henderson, G., King, G. L., Dingledine, R., et al. Appendix: Brain slice methods. Brain Slices. , 381-437 (1984).
- Watson, P. L., Weiner, J. L., Carlen, P. L. Effects of variations in hippocampal slice preparation protocol on the electrophysiological stability, epileptogenicity and graded hypoxia responses of CA1 neurons. Brain Res. 775, 134-143 (1997).
- Frey, U., Krug, M., Reymann, K. G., Matthies, H. Anisomycin, an inhibitor of protein synthesis, blocks late phases of LTP phenomena in the hippocampal CA1 region in vitro. Brain Res. 452 (1-2), 57-65 (1988).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Fonseca, R., Nägerl, U. V., Bonhoeffer, T. Neuronal activity determines the protein synthesis dependence of long-term potentiation. Nat. Neurosci. 9 (4), 478-480 (2006).
- Rudy, J. W. Is there a baby in the bathwater? Maybe: some methodological issues for the de novo protein synthesis hypothesis. Neurobiol. Learn. Mem. 89 (3), 219-224 (2008).
- Sharma, A. V., Nargang, F. E., Dickson, C. T. Neurosilence: Profound Suppression of Neural Activity following Intracerebral Administration of the Protein Synthesis Inhibitor Anisomycin. J. Neurosci. 32 (7), 2377-2387 (2012).
- Volianskis, A., Jensen, M. S. Transient and sustained types of long-term potentiation in the CA1 area of the rat hippocampus. J. Physiol. 550 (2), 459-492 (2003).
- Ris, L., Villers, A., Godaux, E. Synaptic capture-mediated long-lasting long-term potentiation is strongly dependent on mRNA translation. Neuroreport. 20 (17), 1572-1576 (2009).
- Abbas, A. -. K., Dozmorov, M., et al. Persistent LTP without triggered protein synthesis. Neurosci. Res. 63 (1), 59-65 (2009).
- Ho, O. H., Delgado, J. Y., O’Dell, T. J. Phosphorylation of proteins involved in activity-dependent forms of synaptic plasticity is altered in hippocampal slices maintained in vitro. J. Neurochem. 91, 1344-1357 (2004).
- Whittingham, T. S., Lust, W. D., Christakis, D. A., Passonneau, J. V. Metabolic stability of hippocampal slice preparations during prolonged incubation. J. Neurochem. 43, 689-696 (1984).
- Dunlop, D. S., van Elden, W., Lajtha, A. Optimal conditions for protein synthesis in incubated slices of rat brain. Brain Res. 99, 303-318 (1975).
- Taubenfeld, S. M., Stevens, K. A., Pollonini, G., Ruggiero, J., Alberini, C. M. Profound molecular changes following hippocampal slice preparation: loss of AMPA receptor subunits and uncoupled mRNA/protein expression. J. Neurochem. 81 (6), 1348-1360 (2002).
- Gruart, A., Munoz, M. D., Delgado-Garcia, J. M. Involvement of the CA3-CA1 synapse in the acquisition of associative learning in behaving mice. J. Neurosci. 26 (4), 1077-1087 (2006).
- Whitlock, J. R., Heynen, A. J., Shuler, M. G., Bear, M. F. Learning induces long-term potentiation in the hippocampus. Science. 313, 1093-1097 (2006).
- Grant, S. G. N., Silva, A. J. Targeting learning. TINS. 17 (2), 71-75 (1994).
- Izquierdo, I., Medina, J. H., Vianna, M. R. M., Izquierdo, L. A., Barros, B. M. Separate mechanisms for short- and long-term memory. Behav. Brain Res. 103, 1-11 (1999).
- Morice, E., Andreae, L. C., Cooke, S. F., Vanes, L., Fisher, E. M. C., Tybulewicz, V. L. J., Bliss, T. V. P. Preservation of long-term memory and synaptic plasticity despite short-term impairments in the Tc1 mouse model of Down syndrome. Learn Mem. 15 (7), 492-500 (2008).
- Dunlop, D. S., van Elden, W., Plucinska, I., Lajtha, A. Brain Slice Protein Degradation and Development. J. Neurochem. 36, 258-265 (1981).
- Izquierdo, I. Long-term potentiation and the mechanisms of memory. Drug Dev. Res. 30, 1-17 (1993).
