Betere voorbereiding en Conservering van hippocampus Mouse Slices voor een zeer stabiele en reproduceerbare opname van langlopende Potentiëring
Summary
Dit document presenteert een complete methodiek voor te bereiden en te bewaren<em> In vitro</em> Acute hippocampus segmenten van volwassen muizen. Dit protocol omvat de opname van zeer stabiele duurzame lange termijn potentiëring (LTP) voor meer dan 8 uur met een slagingspercentage van 95%.
Abstract
Lange termijn potentiëring (LTP) is een vorm van synaptische plasticiteit gekenmerkt door een toename in kracht en synaptische verondersteld betrokken te zijn bij het geheugen codering. LTP opgewekt in het CA1 regio acute hippocampale plakken is uitgebreid bestudeerd. Maar de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de onderhoudsfase van dit fenomeen nog steeds slecht begrepen. Dit kan gedeeltelijk te wijten aan de verschillende experimentele omstandigheden die door verschillende laboratoria. Inderdaad, de onderhoudsfase LTP is sterk afhankelijk van externe parameters zoals zuurstof, temperatuur en vochtigheid. Het is ook afhankelijk van interne parameters zoals oriëntatie van het vlak snijden en levensvatbaarheid segment na dissectie.
Het optimaliseren van deze parameters kan de inductie van een reproduceerbare en stabiele zeer lange termijn potentiëring. Deze methode biedt de mogelijkheid om de moleculaire mechanismen betrokken bij de stabiele stijging verder onderzoekenin synaptische sterkte in hippocampale plakken. Het benadrukt ook het belang van experimentele condities in in vitro onderzoek naar neurofysiologische verschijnselen.
Introduction
Tegenwoordig is er weinig begrip van hoe complexe herinneringen worden opgeslagen en opgeroepen bij de neuronale circuit niveau. Echter, een verenigende hypothese geheugenopslag is vrij en breed geaccepteerde: geheugen worden opgeslagen als veranderingen in de sterkte van synaptische verbindingen tussen neuronen in het centrale zenuwstelsel. Op zijn eigen, heeft het onderzoek naar de synaptische plasticiteit ruimschoots geprofiteerd van twee baanbrekende ontdekkingen. (1) In een rudimentaire experiment, Bliss en Lomo 1, met het intact verdoofde konijn, vond dat de levering van een korte hoogfrequente (1 sec, 100 Hz) stimulatie van de perforant pad van de hippocampus veroorzaakte een langdurige (enkele uur) toename in de gerelateerde synaptische verbindingen. Dit fascinerende fenomeen werd genoemd "Long-Term Potentiëring" of LTP door Douglas en Goddard in 1975 2. (2) Later werd vastgesteld dat een soortgelijk verschijnsel kan worden geactiveerd in hersenenplakken (0,4 mm) kunstmatig in leven gehouden in vitro </em>. De meest bestudeerde LTP in vitro waargenomen door het leveren van een of meerdere tetani een bundel van axons (de zogenaamde Schaffer collateralen) tijdens het opnemen van het resulterende veld prikkelende synaptische potentieel opgeroepen in de piramidale neuronen van de zogenaamde CA1 regio. De mechanismen van LTP inductie zijn grotendeels geopenbaard. Kortom, een Ca2 + influx door NMDA receptoren activeert enzymen twee gevolgen: a fosforylering van AMPA receptoren (die de efficiëntie verhoogt) en een opname van extra AMPA receptoren in het postsynaptische membraan 3. Daarentegen, de mechanismen van de onderhoudsfase LTP grotendeels onbekend, vooral omdat het experimenteel veel moeilijker om een stukje gezonde vele uren dan gedurende 30 tot 60 minuten behouden.
Veel studies zijn gewijd aan het begrip van mechanismen en LTP interessante theorieën zijn uitgewerkt in de jaren 4-11. Maar until nu, hebben de precieze moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de stabiele toename van synaptische sterkte niet opgehelderd. Dit zou deels te wijten aan de moeilijkheid om eerdere resultaten te reproduceren in verschillende laboratoria met verschillende technieken voor het opstellen en het onderhoud van de hippocampus plakjes. In hun methodologiedocument, Sajikumar et al.. 12 benadrukte het belang van experimentele omstandigheden voor de bereiding van de rat hippocampale plakken en de registratie van stabiele LTP. In deze video presenteren we alle optimalisatiestappen in ons laboratorium ontwikkeld in de jaren kunnen een zeer stabiele LTP opnemen in muis hippocampale plakken.
Deze optimalisatie is gemaakt van protocollen ontwikkeld en met succes gebruikt door andere laboratoria die LTP mechanismen bestuderen in muizen en ratten 13 11. Hiermee ervaren onderzoekers voor inductie en nemen een zeer langdurige LTP in volwassen muizen met een hoge mate van succes. De physiological basis van de geïnduceerde LTP werd zorgvuldig gecontroleerd en aangetoond 14. In deze methodiek papier, tonen wij aan dat alle wijzigingen van de experimentele omstandigheden, zoals temperatuur of oxygenatie een diepgaande invloed op LTP onderhoud kan hebben terwijl de dissectie procedure kan diep wijzigen plakjes prikkelbaarheid. Het moet worden benadrukt dat de precieze controle van al deze parameters vereist een opleiding van enkele maanden voor beginnende studenten.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben in ons laboratorium ontwikkelde een protocol van gecombineerde methoden ontwikkeld en gebruikt door andere laboratoria hebben van een grote deskundigheid op LTP opnamen 11,17. Dit protocol is aangepast om volwassen muis hippocampus en kan worden gebruikt bij dieren van elke leeftijd en elk achtergrond genotype. Ook kan de analyse van LTP in transgene muizen ontwikkelen van neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer 18,19.
Gebruik van dit protocol…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Bernard Foucart voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door het Belgische Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FRS-FNRS) en door de Koningin Elisabeth Fonds voor Medisch Onderzoek. Agnès Villers is Research Fellow aan het Belgische Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek.
Materials
| Reagent/Material | |||
| NaCl | Sigma – Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma – Aldrich | S8875 | |
| KCl | Sigma – Aldrich | P9333 | |
| D-glucose | Sigma – Aldrich | G7528 | |
| NaH2PO4 | Sigma – Aldrich | S9638 | |
| MgSO4 1M | Sigma – Aldrich | 63126 | |
| CaCl2 | Sigma – Aldrich | C4901 | |
| Carbogen | Air Liquide (Belgium) | ||
| Capillaries | WPI, Inc. (UK) | TW150-4 | |
| Stimulating Electrodes | FHC (USA) | CE2B30 | |
| Surgical tools | FST (Germany) | ||
| Filter paper 84 g/m2 | Sartorius | FT-3-105-110 | |
| Mesh | Lycra | 15 den | |
| Glue | UHU | plus endfest300 | |
| Instrument | |||
| Amplifier | WPI, Inc. (UK) | ISO-80 | |
| Interface recording chamber | FST (Germany) | ||
| Peristaltic pumps | Gilson (USA) | Minipuls 3 | |
| Temperature controller | University of Edinburgh | www.etcsystem.com | |
| Tissue Chopper | Mcllwain | ||
| Stimulators | Grass (USA) | S88X + SIU-V | |
| Program analysis | WinLTP | www.winltp.com | |
| Micromanipulators | Narishige | MM-3 and MMO-220A | |
| Surgical microscope | Leica Microsystem | ||
| A/D converter | National Instruments | NIPCI-6229 M-series |
Referências
- Bliss, T. V., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J. Physiol. 232 (2), 331-356 (1973).
- Douglas, R. M., Goddard, G. V. Long-term potentiation of the perforant path-granule cell synapse in the rat hippocampus. Brain Res. 86, 205-215 (1975).
- Squire, L., Kandel, E. . Memory: From mind to molecules. , (1999).
- Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP. Science. 265 (5175), 1104-1107 (1994).
- Frey, U., Morris, R. G. Synaptic tagging and long-term potentiation. Nature. 385 (6616), 533-536 (1038).
- Bortolotto, Z. A., Collingridge, G. L. A role for protein kinase C in a form of metaplasticity that regulates the induction of long-term potentiation at CA1 synapses of the adult rat hippocampus. Eur. J. Neurosci. 12 (11), 4055-4062 (2000).
- Migues, P. V., Hardt, O., et al. PKMzeta maintains memories by regulating GluR2-dependent AMPA receptor trafficking. Nat. Neurosci. 13 (5), 630-634 (2010).
- Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. -. C., Choquet, D. Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity. Neuron. 54 (3), 447-460 (2007).
- Vickers, C. A., Dickson, K. S., Wyllie, D. J. A. Induction and maintenance of late-phase long-term potentiation in isolated dendrites of rat hippocampal CA1 pyramidal neurones. J. Physiol. 568 (3), 803-813 (2005).
- Fonseca, R. Activity-dependent actin dynamics are required for the maintenance of long-term plasticity and for synaptic capture. Eur. J. Neurosci. 35 (2), 195-206 (2012).
- Redondo, R. L., Okuno, H., Spooner, P. A., Frenguelli, B. G., Bito, H., Morris, R. G. M. Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation. J. Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).
- Sajikumar, S., Navakkode, S., Frey, J. U. Protein synthesis-dependent long-term functional plasticity: methods and techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 15 (5), 607-613 (2005).
- Connor, S. A., Wang, Y. T., Nguyen, P. V. Activation of beta-adrenergic receptors facilitates heterosynaptic translation-dependent long-term potentiation. J. Physiol. 589 (17), 4321-4340 (2011).
- Villers, A., Godaux, E., Ris, L. Long-lasting LTP requires neither repeated trains for its induction nor protein synthesis for its development. PLoS One. 7 (7), e40823 (2012).
- Capron, B., Sindic, C., Godaux, E., Ris, L. The characteristics of LTP induced in hippocampal slices are dependent on slice-recovery conditions. Learn. Mem. 13 (3), 271-277 (2006).
- Villers, A., Godaux, E., Ris, L. Late phase of L-LTP elicited in isolated CA1 dendrites cannot be transferred by synaptic capture. Neuroreport. 21, 210-215 (2010).
- Nguyen, P. V., Kandel, E. R. Brief theta-burst stimulation induces a transcription-dependent late phase of LTP requiring cAMP in area CA1 of the mouse hippocampus. Learn. Mem. 4 (2), 230-243 (1997).
- Dewachter, I., Ris, L., et al. Modulation of synaptic plasticity and Tau phosphorylation by wild-type and mutant presenilin1. Neurobiol. Aging. 29 (5), 639-652 (2008).
- Dewachter, I., Filipkowski, R. K., et al. Deregulation of NMDA-receptor function and down-stream signaling in APP[V717I] transgenic mice. Neurobiol. Aging. 30 (2), 241-256 (2009).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology. J. Vis. Exp. (49), e2330 (2011).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J. Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).
- Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity. Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).
- Alger, B. E., Dhanjal, S. S., Dingledine, R., Garthwaite, J., Henderson, G., King, G. L., Dingledine, R., et al. Appendix: Brain slice methods. Brain Slices. , 381-437 (1984).
- Watson, P. L., Weiner, J. L., Carlen, P. L. Effects of variations in hippocampal slice preparation protocol on the electrophysiological stability, epileptogenicity and graded hypoxia responses of CA1 neurons. Brain Res. 775, 134-143 (1997).
- Frey, U., Krug, M., Reymann, K. G., Matthies, H. Anisomycin, an inhibitor of protein synthesis, blocks late phases of LTP phenomena in the hippocampal CA1 region in vitro. Brain Res. 452 (1-2), 57-65 (1988).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Fonseca, R., Nägerl, U. V., Bonhoeffer, T. Neuronal activity determines the protein synthesis dependence of long-term potentiation. Nat. Neurosci. 9 (4), 478-480 (2006).
- Rudy, J. W. Is there a baby in the bathwater? Maybe: some methodological issues for the de novo protein synthesis hypothesis. Neurobiol. Learn. Mem. 89 (3), 219-224 (2008).
- Sharma, A. V., Nargang, F. E., Dickson, C. T. Neurosilence: Profound Suppression of Neural Activity following Intracerebral Administration of the Protein Synthesis Inhibitor Anisomycin. J. Neurosci. 32 (7), 2377-2387 (2012).
- Volianskis, A., Jensen, M. S. Transient and sustained types of long-term potentiation in the CA1 area of the rat hippocampus. J. Physiol. 550 (2), 459-492 (2003).
- Ris, L., Villers, A., Godaux, E. Synaptic capture-mediated long-lasting long-term potentiation is strongly dependent on mRNA translation. Neuroreport. 20 (17), 1572-1576 (2009).
- Abbas, A. -. K., Dozmorov, M., et al. Persistent LTP without triggered protein synthesis. Neurosci. Res. 63 (1), 59-65 (2009).
- Ho, O. H., Delgado, J. Y., O’Dell, T. J. Phosphorylation of proteins involved in activity-dependent forms of synaptic plasticity is altered in hippocampal slices maintained in vitro. J. Neurochem. 91, 1344-1357 (2004).
- Whittingham, T. S., Lust, W. D., Christakis, D. A., Passonneau, J. V. Metabolic stability of hippocampal slice preparations during prolonged incubation. J. Neurochem. 43, 689-696 (1984).
- Dunlop, D. S., van Elden, W., Lajtha, A. Optimal conditions for protein synthesis in incubated slices of rat brain. Brain Res. 99, 303-318 (1975).
- Taubenfeld, S. M., Stevens, K. A., Pollonini, G., Ruggiero, J., Alberini, C. M. Profound molecular changes following hippocampal slice preparation: loss of AMPA receptor subunits and uncoupled mRNA/protein expression. J. Neurochem. 81 (6), 1348-1360 (2002).
- Gruart, A., Munoz, M. D., Delgado-Garcia, J. M. Involvement of the CA3-CA1 synapse in the acquisition of associative learning in behaving mice. J. Neurosci. 26 (4), 1077-1087 (2006).
- Whitlock, J. R., Heynen, A. J., Shuler, M. G., Bear, M. F. Learning induces long-term potentiation in the hippocampus. Science. 313, 1093-1097 (2006).
- Grant, S. G. N., Silva, A. J. Targeting learning. TINS. 17 (2), 71-75 (1994).
- Izquierdo, I., Medina, J. H., Vianna, M. R. M., Izquierdo, L. A., Barros, B. M. Separate mechanisms for short- and long-term memory. Behav. Brain Res. 103, 1-11 (1999).
- Morice, E., Andreae, L. C., Cooke, S. F., Vanes, L., Fisher, E. M. C., Tybulewicz, V. L. J., Bliss, T. V. P. Preservation of long-term memory and synaptic plasticity despite short-term impairments in the Tc1 mouse model of Down syndrome. Learn Mem. 15 (7), 492-500 (2008).
- Dunlop, D. S., van Elden, W., Plucinska, I., Lajtha, A. Brain Slice Protein Degradation and Development. J. Neurochem. 36, 258-265 (1981).
- Izquierdo, I. Long-term potentiation and the mechanisms of memory. Drug Dev. Res. 30, 1-17 (1993).
