Verbesserte Zubereitung und Konservierung von Hippocampus Maus Slices für eine sehr stabile und reproduzierbare Erfassung der Langzeit-Potenzierung
Summary
Dieser Beitrag stellt eine komplette Methode für die Vorbereitung und die Erhaltung<em> In vitro</em> Akuten Schnitten des Hippocampus von erwachsenen Mäusen. Dieses Protokoll ermöglicht die Aufnahme von sehr stabilen langlebigen Langzeit-Potenzierung (LTP) für mehr als 8 Stunden mit einer Erfolgsquote von 95%.
Abstract
Langzeitpotenzierung (LTP) ist eine Art der synaptischen Plastizität durch eine Erhöhung der synaptischen Stärke aus und vermutlich in Gedächtniscodierung einbezogen werden. LTP ausgelöst in der CA1-Region des akuten Schnitten des Hippocampus ist eingehend untersucht worden. Allerdings sind die molekularen Mechanismen der Erhaltungsphase für dieses Phänomen sind noch weitgehend unverstanden. Dies könnte teilweise auf den verschiedenen experimentellen Bedingungen durch verschiedene Laboratorien. Tatsächlich ist der Erhaltungsphase der LTP stark von äußeren Parametern wie Sauerstoffversorgung, Temperatur und Luftfeuchtigkeit. Es hängt auch von internen Parametern wie Orientierung der Schnittebene und Scheibe Lebensfähigkeit nach der Sektion.
Die Optimierung all dieser Parameter ermöglicht die Induktion einer sehr reproduzierbar und sehr stabile Langzeit-Potenzierung. Diese Methode bietet die Möglichkeit, weiter zu erforschen die molekularen Mechanismen in der stabilen Anstieg beteiligtder synaptischen Stärke in Hippocampus. Es unterstreicht auch die Bedeutung der experimentellen Bedingungen in in vitro Untersuchung der neurophysiologischen Phänomene.
Introduction
Heutzutage gibt es nur begrenzte Verständnis davon, wie komplex Erinnerungen gespeichert und abgerufen am neuronalen Schaltkreis-Niveau. Allerdings ist eine einheitliche Hypothese von Speicher verfügbar und breit akzeptiert: Erinnerungen werden als Änderungen in der Stärke der synaptischen Verbindungen zwischen den Neuronen im zentralen Nervensystem gespeichert. Auf seiner eigenen, hat die Forschung auf die synaptische Plastizität im Wesentlichen aus zwei bahnbrechende Entdeckungen profitiert. (1) In ein bahnbrechendes Experiment, Bliss und Lomo 1, mit dem intakten narkotisierten Kaninchen, festgestellt, dass die Lieferung von einer kurzen Hochfrequenz-(1 sec, 100 Hz) Stimulation des perforant Pfad des Hippocampus eine dauerhafte (mehrere verursacht Stunden) erhöhen in den zugehörigen synaptischen Verbindungen. Dieses faszinierende Phänomen wurde "Langzeit-Potenzierung" oder LTP von Douglas und Goddard als in 1975 2. (2) später, wurde festgestellt, dass ein ähnliches Phänomen in Gehirnscheiben ausgelöst werden konnte (0,4 mm) künstlich aufrechterhalten in vitro lebendig </em>. Die am häufigsten untersuchten LTP wurde in vitro durch die Bereitstellung einer oder mehrerer tetani, um ein Bündel von Axonen (die sogenannten Schaffer-Kollateralen) bei der Aufnahme das resultierende Feld erregenden synaptischen Potential in den Pyramidenzellen der sogenannten CA1-Region hervorgerufen beobachtet. Die Mechanismen der LTP Induktion weitgehend aufgedeckt worden. Grundsätzlich aktiviert ein Ca 2 +-Einstrom durch den NMDA-Rezeptoren Enzyme mit zwei Folgen: eine Phosphorylierung von AMPA-Rezeptoren (die steigert so deren Effizienz) und eine Aufnahme von zusätzlichen AMPA-Rezeptoren in der postsynaptischen Membran 3. Im Gegensatz dazu sind die Mechanismen der Erhaltungsphase der LTP weitgehend unbekannt, vor allem weil es experimentell sehr viel schwieriger, eine Scheibe gesund für viele Stunden als für 30 bis 60 min zu halten ist.
Viele Studien haben zum Verständnis der Mechanismen LTP und interessante Theorien gewidmet haben über die Jahre 4-11 ausgearbeitet. Aber unbis jetzt, haben die genauen molekularen Mechanismen der stabilen Anstieg der synaptischen Stärke nicht geklärt. Dies kann zum Teil auf die Schwierigkeit mit vorherigen Messungen in verschiedenen Laboratorien mit verschiedenen Techniken zur Herstellung reproduzieren und die Aufrechterhaltung des Hippocampus. In ihrer Methodik Papier betonte Sajikumar et al. 12 die Bedeutung von experimentellen Bedingungen für die Herstellung von Ratte Hippocampus und der Aufnahme stabil LTP. In diesem Video stellen wir Ihnen alle Optimierungsschritte in unserem Labor im Laufe der Jahre entwickelt, um der Lage sein, eine sehr stabile LTP in Maus Hippocampus aufzeichnen.
Diese Optimierung wurde von Protokollen entwickelt und erfolgreich eingesetzt von anderen Laboratorien, die LTP-Mechanismen Studie an Mäusen und Ratten 13 11 vorgenommen. Es ermöglicht erfahrenen Forscher zu induzieren und aufzeichnen eine sehr lang anhaltende LTP in erwachsenen Mäusen mit einer hohen Erfolgsquote. Die physiological Grundlage der induzierten LTP wurde sorgfältig geprüft und nachgewiesen 14. In dieser Methodik Papier zeigen wir, dass alle Änderungen der experimentellen Bedingungen, wie Temperatur oder Sauerstoffsättigung kann eine tief greifende Auswirkungen auf die LTP Wartung haben während der Dissektion Verfahren stark verändern können Scheiben Erregbarkeit. Es muss auch betont werden, dass die präzise Steuerung all dieser Parameter eine Ausbildung von mehreren Monaten für unerfahrene Studenten benötigt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben in unserem Labor ein Protokoll aus der Kombination von Methoden entwickelt und eingesetzt von anderen Laboratorien mit einem großen Know-how in LTP Aufnahmen 11,17 entwickelt. Dieses Protokoll wird zur adulten Maus Hippocampus angepasst und kann bei Tieren jeden Alters und jeder Genotyp Hintergrund verwendet werden. Es ermöglicht auch die Analyse von LTP in transgenen Mäusen Entwicklung neurodegenerativer Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit 18,19.
Die Verw…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Bernard Foucart für technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der belgischen Fonds für wissenschaftliche Forschung (FRS-FNRS) und von der Königin Elisabeth Fonds für medizinische Forschung unterstützt. Agnès Villers ist Research Fellow an der belgischen Fonds für wissenschaftliche Forschung.
Materials
| Reagent/Material | |||
| NaCl | Sigma – Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma – Aldrich | S8875 | |
| KCl | Sigma – Aldrich | P9333 | |
| D-glucose | Sigma – Aldrich | G7528 | |
| NaH2PO4 | Sigma – Aldrich | S9638 | |
| MgSO4 1M | Sigma – Aldrich | 63126 | |
| CaCl2 | Sigma – Aldrich | C4901 | |
| Carbogen | Air Liquide (Belgium) | ||
| Capillaries | WPI, Inc. (UK) | TW150-4 | |
| Stimulating Electrodes | FHC (USA) | CE2B30 | |
| Surgical tools | FST (Germany) | ||
| Filter paper 84 g/m2 | Sartorius | FT-3-105-110 | |
| Mesh | Lycra | 15 den | |
| Glue | UHU | plus endfest300 | |
| Instrument | |||
| Amplifier | WPI, Inc. (UK) | ISO-80 | |
| Interface recording chamber | FST (Germany) | ||
| Peristaltic pumps | Gilson (USA) | Minipuls 3 | |
| Temperature controller | University of Edinburgh | www.etcsystem.com | |
| Tissue Chopper | Mcllwain | ||
| Stimulators | Grass (USA) | S88X + SIU-V | |
| Program analysis | WinLTP | www.winltp.com | |
| Micromanipulators | Narishige | MM-3 and MMO-220A | |
| Surgical microscope | Leica Microsystem | ||
| A/D converter | National Instruments | NIPCI-6229 M-series |
Referências
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