הכנה משופרת ושימור פרוסות עכבר היפוקמפוס להקלטה יציבה מאוד ושחזור של הגברה לטווח ארוך
Summary
מאמר זה מציג מתודולוגיה שלמה להכין ולשמור<em> במבחנה</em> פרוסות בהיפוקמפוס חריפות מעכברים בוגרים. פרוטוקול זה מאפשר הקלטה של הגברה לטווח ארוך לטווח ארוך מאוד יציב (LTP) ליותר מ 8 שעות עם שיעור הצלחה של 95%.
Abstract
הגברה לטווח ארוך (LTP) הוא סוג של פלסטיות הסינפטית מתאפיין בעלייה בכח הסינפטי והאמינה להיות מעורבים בקידוד זיכרון. LTP שהושרו באזור CA1 של פרוסות בהיפוקמפוס חריפות, נחקר בהרחבה. עם זאת את המנגנונים המולקולריים שבבסיס שלב התחזוקה של תופעה זו עדיין הם הבינו היטב. זה יכול להיות גם בגלל תנאי הניסוי השונים המשמשים במעבדות שונות. ואכן, שלב התחזוקה של-LTP הוא מאוד תלוי בפרמטרים חיצוניים כמו חמצון, טמפרטורה ולחות. זה גם תלוי בפרמטרים פנימיים, כמו נטייה של מטוס החיתוך וכדאיות פרוסה לאחר נתיחה.
אופטימיזציה של כל הפרמטרים הללו מאפשרת אינדוקציה של potentiation מאוד לשחזור ומאוד יציב לטווח ארוך. מתודולוגיה זו מציעה את האפשרות להמשיך לחקור את המנגנונים המולקולריים מעורבים בגידול היציבבחוזק סינפטי בפרוסות בהיפוקמפוס. זה גם מדגיש את החשיבות של תנאי ניסוי במבחנה בחקירה של תופעות neurophysiological.
Introduction
כיום, יש הבנה מוגבלת של איך זכרונות מאוחסנים מורכבים ונזכרו ברמת המעגל העצבית. עם זאת, השערה מאחדת של זכרון אחסון זמינה ומקובל באופן כללי: זכרונות מאוחסנים כשינויים בעוצמת קשרים סינפטיים בין תאי עצב במערכת העצבים המרכזית. בכוחות עצמו, מחקר על פלסטיות הסינפטית יש נהנה במידה רבה משתי תגליות פריצת דרך. (1) בניסוי זרע, בליס ו1 Lomo, תוך שימוש בהרדמה הארנב בשלמותה, מצאו כי מסירה של תדר גבוה קצר (1 שניות, 100 הרץ) גירוי לנתיב perforant של ההיפוקמפוס שנגרמה לטווח ארוך (כמה שעות) להגדיל בקשרים סינפטיים בנושא. תופעה מרתקת זו נקראה "הגברה לטווח ארוך" או LTP על ידי דאגלס וגודארד בשנת 1975 2. (2) בהמשך, נמצא כי תופעה דומה יכולה להיות מופעלת בפרוסות מוח (0.4 מ"מ) באופן מלאכותי נשמר בחיים במבחנה </eמ '>. LTP הנחקר ביותר נצפה במבחנה על ידי מתן אחד או כמה tetani לחבילה של אקסונים (ביטחונות שפר כביכול) בעת הקלטת הפוטנציאל עורר בנוירונים פירמידליים של מה שמכונה אזור CA1 הסינפטי מעורר שדה שנוצר. המנגנונים של האינדוקציה LTP שהתגלו במידה רבה. בעיקרון, 2 + Ca זרם דרך קולטני NMDA מפעיל אנזימים עם שתי תוצאות: זירחון של קולטני AMPA (אשר מגדיל את היעילות שלהם) ושילוב של קולטני AMPA נוסף בקרום postsynaptic 3. לעומת זאת, את המנגנונים של שלב התחזוקה של-LTP הם ידועים ברובו, בעיקר משום שהוא בניסוי הרבה יותר קשה לשמור על נתח בריא במשך שעות רבות יותר מאשר ל30 עד 60 דקות.
הרבה מחקרים הוקדשו להבנת מנגנוני LTP ותאוריות מעניינות כבר הרחיב במהלך השנים 4-11. אבל האו"םtil עכשיו, את המנגנונים המולקולריים שבבסיס המדויק גידול היציב בחוזק סינפטי לא הובהרו. זה יכול להיות גם בגלל הקושי לשחזר תוצאות קודמות במעבדות שונות תוך שימוש בטכניקות שונות להכנה והתחזוקה של פרוסות בהיפוקמפוס. בנייר המתודולוגיה שלהם, Sajikumar et al. -12 הדגיש את החשיבות של תנאי ניסוי להכנת פרוסות בהיפוקמפוס חולדה וההקלטה של LTP היציב. בסרטון הזה אנו מציגים את כל שלבי אופטימיזציה שפותחו במעבדה שלנו במשך השנים כדי להיות מסוגל להקליט LTP יציב מאוד בפרוסות בהיפוקמפוס עכבר.
אופטימיזציה זו נעשתה מפרוטוקולים שפותחו ושימש בהצלחה על ידי מעבדות אחרות שלומדות מנגנוני LTP בעכברי 13 ו 11 חולדות. זה מאפשר לחוקרים מנוסים כדי לגרום ולהקליט LTP טווח ארוך מאוד בעכברים בוגרים עם שיעור גבוה של הצלחה. עמ 'בסיס hysiological של LTP המושרה נבדק בקפידה והפגין 14. בנייר מתודולוגיה זו, אנו מראים כי כל שינוי של תנאי ניסוי, כמו טמפרטורה או חמצון יכול להיות השפעה עמוקה על תחזוקת LTP בעוד הליך הנתיחה יכול לשנות רגישות עמוקה פרוסות. כמו כן, יש להדגיש כי השליטה המדויקת של כל הפרמטרים הללו דורשת הכשרה של מספר חודשים לתלמידים מתחילים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פיתחנו במעבדה שלנו וכתוצאה מפרוטוקול השילוב של שיטות שפותחו והופעל על ידי מעבדות אחרות בעלי מומחיות גדולה בLTP הקלטות 11,17. פרוטוקול זה מותאם ליפוקמפוס עכבר המבוגר, וניתן להשתמש בבעלי חיים, בכל גיל ובכל גנוטיפ רקע. זה גם מאפשר ניתוח של LTP בעכברים מהונדסים לפתח מחל?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ברנרד Foucart לקבלת סיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הבלגית למחקר מדעי (FRS-FNRS) ועל ידי קרן מלכת אליזבט למחקר רפואי. אגנס Villers הוא עמית מחקר בקרן הבלגית למחקר מדעי.
Materials
| Reagent/Material | |||
| NaCl | Sigma – Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma – Aldrich | S8875 | |
| KCl | Sigma – Aldrich | P9333 | |
| D-glucose | Sigma – Aldrich | G7528 | |
| NaH2PO4 | Sigma – Aldrich | S9638 | |
| MgSO4 1M | Sigma – Aldrich | 63126 | |
| CaCl2 | Sigma – Aldrich | C4901 | |
| Carbogen | Air Liquide (Belgium) | ||
| Capillaries | WPI, Inc. (UK) | TW150-4 | |
| Stimulating Electrodes | FHC (USA) | CE2B30 | |
| Surgical tools | FST (Germany) | ||
| Filter paper 84 g/m2 | Sartorius | FT-3-105-110 | |
| Mesh | Lycra | 15 den | |
| Glue | UHU | plus endfest300 | |
| Instrument | |||
| Amplifier | WPI, Inc. (UK) | ISO-80 | |
| Interface recording chamber | FST (Germany) | ||
| Peristaltic pumps | Gilson (USA) | Minipuls 3 | |
| Temperature controller | University of Edinburgh | www.etcsystem.com | |
| Tissue Chopper | Mcllwain | ||
| Stimulators | Grass (USA) | S88X + SIU-V | |
| Program analysis | WinLTP | www.winltp.com | |
| Micromanipulators | Narishige | MM-3 and MMO-220A | |
| Surgical microscope | Leica Microsystem | ||
| A/D converter | National Instruments | NIPCI-6229 M-series |
Referências
- Bliss, T. V., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J. Physiol. 232 (2), 331-356 (1973).
- Douglas, R. M., Goddard, G. V. Long-term potentiation of the perforant path-granule cell synapse in the rat hippocampus. Brain Res. 86, 205-215 (1975).
- Squire, L., Kandel, E. . Memory: From mind to molecules. , (1999).
- Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP. Science. 265 (5175), 1104-1107 (1994).
- Frey, U., Morris, R. G. Synaptic tagging and long-term potentiation. Nature. 385 (6616), 533-536 (1038).
- Bortolotto, Z. A., Collingridge, G. L. A role for protein kinase C in a form of metaplasticity that regulates the induction of long-term potentiation at CA1 synapses of the adult rat hippocampus. Eur. J. Neurosci. 12 (11), 4055-4062 (2000).
- Migues, P. V., Hardt, O., et al. PKMzeta maintains memories by regulating GluR2-dependent AMPA receptor trafficking. Nat. Neurosci. 13 (5), 630-634 (2010).
- Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. -. C., Choquet, D. Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity. Neuron. 54 (3), 447-460 (2007).
- Vickers, C. A., Dickson, K. S., Wyllie, D. J. A. Induction and maintenance of late-phase long-term potentiation in isolated dendrites of rat hippocampal CA1 pyramidal neurones. J. Physiol. 568 (3), 803-813 (2005).
- Fonseca, R. Activity-dependent actin dynamics are required for the maintenance of long-term plasticity and for synaptic capture. Eur. J. Neurosci. 35 (2), 195-206 (2012).
- Redondo, R. L., Okuno, H., Spooner, P. A., Frenguelli, B. G., Bito, H., Morris, R. G. M. Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation. J. Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).
- Sajikumar, S., Navakkode, S., Frey, J. U. Protein synthesis-dependent long-term functional plasticity: methods and techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 15 (5), 607-613 (2005).
- Connor, S. A., Wang, Y. T., Nguyen, P. V. Activation of beta-adrenergic receptors facilitates heterosynaptic translation-dependent long-term potentiation. J. Physiol. 589 (17), 4321-4340 (2011).
- Villers, A., Godaux, E., Ris, L. Long-lasting LTP requires neither repeated trains for its induction nor protein synthesis for its development. PLoS One. 7 (7), e40823 (2012).
- Capron, B., Sindic, C., Godaux, E., Ris, L. The characteristics of LTP induced in hippocampal slices are dependent on slice-recovery conditions. Learn. Mem. 13 (3), 271-277 (2006).
- Villers, A., Godaux, E., Ris, L. Late phase of L-LTP elicited in isolated CA1 dendrites cannot be transferred by synaptic capture. Neuroreport. 21, 210-215 (2010).
- Nguyen, P. V., Kandel, E. R. Brief theta-burst stimulation induces a transcription-dependent late phase of LTP requiring cAMP in area CA1 of the mouse hippocampus. Learn. Mem. 4 (2), 230-243 (1997).
- Dewachter, I., Ris, L., et al. Modulation of synaptic plasticity and Tau phosphorylation by wild-type and mutant presenilin1. Neurobiol. Aging. 29 (5), 639-652 (2008).
- Dewachter, I., Filipkowski, R. K., et al. Deregulation of NMDA-receptor function and down-stream signaling in APP[V717I] transgenic mice. Neurobiol. Aging. 30 (2), 241-256 (2009).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology. J. Vis. Exp. (49), e2330 (2011).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J. Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).
- Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity. Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).
- Alger, B. E., Dhanjal, S. S., Dingledine, R., Garthwaite, J., Henderson, G., King, G. L., Dingledine, R., et al. Appendix: Brain slice methods. Brain Slices. , 381-437 (1984).
- Watson, P. L., Weiner, J. L., Carlen, P. L. Effects of variations in hippocampal slice preparation protocol on the electrophysiological stability, epileptogenicity and graded hypoxia responses of CA1 neurons. Brain Res. 775, 134-143 (1997).
- Frey, U., Krug, M., Reymann, K. G., Matthies, H. Anisomycin, an inhibitor of protein synthesis, blocks late phases of LTP phenomena in the hippocampal CA1 region in vitro. Brain Res. 452 (1-2), 57-65 (1988).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Fonseca, R., Nägerl, U. V., Bonhoeffer, T. Neuronal activity determines the protein synthesis dependence of long-term potentiation. Nat. Neurosci. 9 (4), 478-480 (2006).
- Rudy, J. W. Is there a baby in the bathwater? Maybe: some methodological issues for the de novo protein synthesis hypothesis. Neurobiol. Learn. Mem. 89 (3), 219-224 (2008).
- Sharma, A. V., Nargang, F. E., Dickson, C. T. Neurosilence: Profound Suppression of Neural Activity following Intracerebral Administration of the Protein Synthesis Inhibitor Anisomycin. J. Neurosci. 32 (7), 2377-2387 (2012).
- Volianskis, A., Jensen, M. S. Transient and sustained types of long-term potentiation in the CA1 area of the rat hippocampus. J. Physiol. 550 (2), 459-492 (2003).
- Ris, L., Villers, A., Godaux, E. Synaptic capture-mediated long-lasting long-term potentiation is strongly dependent on mRNA translation. Neuroreport. 20 (17), 1572-1576 (2009).
- Abbas, A. -. K., Dozmorov, M., et al. Persistent LTP without triggered protein synthesis. Neurosci. Res. 63 (1), 59-65 (2009).
- Ho, O. H., Delgado, J. Y., O’Dell, T. J. Phosphorylation of proteins involved in activity-dependent forms of synaptic plasticity is altered in hippocampal slices maintained in vitro. J. Neurochem. 91, 1344-1357 (2004).
- Whittingham, T. S., Lust, W. D., Christakis, D. A., Passonneau, J. V. Metabolic stability of hippocampal slice preparations during prolonged incubation. J. Neurochem. 43, 689-696 (1984).
- Dunlop, D. S., van Elden, W., Lajtha, A. Optimal conditions for protein synthesis in incubated slices of rat brain. Brain Res. 99, 303-318 (1975).
- Taubenfeld, S. M., Stevens, K. A., Pollonini, G., Ruggiero, J., Alberini, C. M. Profound molecular changes following hippocampal slice preparation: loss of AMPA receptor subunits and uncoupled mRNA/protein expression. J. Neurochem. 81 (6), 1348-1360 (2002).
- Gruart, A., Munoz, M. D., Delgado-Garcia, J. M. Involvement of the CA3-CA1 synapse in the acquisition of associative learning in behaving mice. J. Neurosci. 26 (4), 1077-1087 (2006).
- Whitlock, J. R., Heynen, A. J., Shuler, M. G., Bear, M. F. Learning induces long-term potentiation in the hippocampus. Science. 313, 1093-1097 (2006).
- Grant, S. G. N., Silva, A. J. Targeting learning. TINS. 17 (2), 71-75 (1994).
- Izquierdo, I., Medina, J. H., Vianna, M. R. M., Izquierdo, L. A., Barros, B. M. Separate mechanisms for short- and long-term memory. Behav. Brain Res. 103, 1-11 (1999).
- Morice, E., Andreae, L. C., Cooke, S. F., Vanes, L., Fisher, E. M. C., Tybulewicz, V. L. J., Bliss, T. V. P. Preservation of long-term memory and synaptic plasticity despite short-term impairments in the Tc1 mouse model of Down syndrome. Learn Mem. 15 (7), 492-500 (2008).
- Dunlop, D. S., van Elden, W., Plucinska, I., Lajtha, A. Brain Slice Protein Degradation and Development. J. Neurochem. 36, 258-265 (1981).
- Izquierdo, I. Long-term potentiation and the mechanisms of memory. Drug Dev. Res. 30, 1-17 (1993).
