दीर्घकालिक potentiation की एक बहुत ही स्थिर और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रिकॉर्डिंग के लिए बेहतर तैयारी और hippocampal माउस स्लाइस का संरक्षण
Summary
इस पत्र को तैयार करने और बनाए रखने के लिए एक पूरी कार्यप्रणाली प्रस्तुत<em> इन विट्रो में</emवयस्क चूहों से> तीव्र hippocampal स्लाइस. इस प्रोटोकॉल 95% की सफलता दर के साथ अधिक से अधिक 8 घंटे के लिए बहुत स्थिर लंबे समय से स्थायी दीर्घकालिक potentiation (LTP) की रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है.
Abstract
दीर्घकालिक potentiation (LTP) अन्तर्ग्रथनी शक्ति में वृद्धि की विशेषता synaptic plasticity का एक प्रकार है और स्मृति एन्कोडिंग में शामिल होने का विश्वास. एलटीपी बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है तीव्र hippocampal स्लाइस की CA1 क्षेत्र में हासिल. हालांकि इस घटना के रखरखाव चरण अंतर्निहित आणविक तंत्र अभी भी खराब समझ रहे हैं. यह अलग प्रयोगशालाओं द्वारा प्रयुक्त विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों की वजह से हो सकता है. दरअसल, एलटीपी के रखरखाव चरण ऑक्सीजन, तापमान और नमी की तरह बाहरी मापदंडों पर निर्भर है. यह भी विच्छेदन के बाद टुकड़ा करने की क्रिया विमान और टुकड़ा व्यवहार्यता के उन्मुखीकरण की तरह आंतरिक मापदंडों पर निर्भर है.
इन सभी मानकों के अनुकूलन एक बहुत प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और बहुत स्थिर दीर्घकालिक potentiation के शामिल होने में सक्षम बनाता है. इस पद्धति को आगे स्थिर वृद्धि में शामिल आणविक तंत्र का पता लगाने की संभावना प्रदान करताhippocampal स्लाइस में synaptic ताकत में. यह भी neurophysiological घटना की इन विट्रो जांच में में प्रयोगात्मक शर्तों के महत्व पर प्रकाश डाला गया.
Introduction
आजकल, जटिल यादें संग्रहित और neuronal सर्किट स्तर पर याद किया जाता है की सीमित समझ है. हालांकि, स्मृति भंडारण की एक एकीकृत परिकल्पना उपलब्ध है और मोटे तौर पर स्वीकार कर लिया है: यादों के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में न्यूरॉन्स के बीच synaptic कनेक्शन की ताकत में परिवर्तन के रूप में जमा हो जाती है. अपने दम पर, synaptic plasticity पर अनुसंधान काफी हद तक दो सफलता खोजों से लाभ हुआ है. (1) में बरकरार संवेदनाहृत खरगोश का उपयोग कर एक मौलिक प्रयोग, परमानंद और लोमो 1, एक संक्षिप्त उच्च आवृत्ति (1 सेकंड, 100 हर्ट्ज) हिप्पोकैम्पस के पर्फोरेंट पथ को उत्तेजना का वितरण एक लंबे समय से स्थायी (कई कारण बना घंटे) से संबंधित synaptic कनेक्शन में वृद्धि हुई है. यह दिलचस्प घटना 1975 2 में डगलस और गोडार्ड द्वारा "दीर्घकालिक potentiation" या एलटीपी बुलाया गया था. (2) बाद में, यह एक ऐसी ही घटना (0.4 मिमी) मस्तिष्क स्लाइसें में शुरू किया जा सकता है पाया गया है कि कृत्रिम रूप से इन विट्रो में जिंदा बनाए रखा </eमीटर>. सबसे व्यापक रूप से अध्ययन एलटीपी तथाकथित CA1 क्षेत्र के पिरामिड न्यूरॉन्स में पैदा परिणामस्वरूप क्षेत्र उत्तेजक अन्तर्ग्रथनी संभावित रिकॉर्डिंग जबकि एक्सोन (तथाकथित Schaffer कोलेटरल) का एक बंडल को एक या कई tetani देने से इन विट्रो में मनाया गया. एलटीपी प्रेरण का तंत्र काफी हद तक खुलासा किया गया है. AMPA रिसेप्टर्स की एक phosphorylation (उनकी क्षमता बढ़ जाती है) और postsynaptic झिल्ली 3 में अतिरिक्त AMPA रिसेप्टर्स का समावेश: असल में, NMDA रिसेप्टर्स के माध्यम से एक सीए 2 + तांता दो परिणामों के साथ एंजाइमों को सक्रिय करता है. यह प्रयोगात्मक और अधिक कठिन 30 से 60 मिनट के लिए की तुलना में कई घंटे के लिए स्वस्थ एक टुकड़ा बनाए रखने के लिए विशेष रूप से, क्योंकि इसके विपरीत, एलटीपी के रखरखाव चरण के तंत्र काफी हद तक अनजान हैं.
अध्ययन का एक बहुत एलटीपी तंत्र और दिलचस्प सिद्धांत को समझने के लिए समर्पित किया गया है साल के 4-11 से अधिक सविस्तार किया गया है. लेकिन संयुक्त राष्ट्रटिल अब, अन्तर्ग्रथनी शक्ति में स्थिर वृद्धि अंतर्निहित सटीक आणविक तंत्र स्पष्ट नहीं किया गया है. इस तैयारी के लिए विभिन्न तकनीकों का उपयोग विभिन्न प्रयोगशालाओं में पिछले परिणामों को पुन: पेश करने के लिए कठिनाई और hippocampal स्लाइस के रखरखाव के लिए आंशिक रूप से कारण हो सकता है. उनकी कार्यप्रणाली पत्र में, Sajikumar एट अल. 12 चूहा hippocampal स्लाइस और स्थिर एलटीपी की रिकॉर्डिंग की तैयारी के लिए प्रयोगात्मक शर्तों के महत्व पर बल दिया. इस वीडियो में हम माउस hippocampal स्लाइस में एक बहुत ही स्थिर एलटीपी रिकॉर्ड करने में सक्षम होने के लिए पिछले कुछ वर्षों में हमारी प्रयोगशाला में विकसित सभी अनुकूलन कदम उपस्थित थे.
यह अनुकूलन चूहों 13 और चूहों 11 में LTP तंत्र का अध्ययन है, जो अन्य प्रयोगशालाओं द्वारा विकसित की है और सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल से बनाया गया है. यह अनुभवी शोधकर्ताओं प्रेरित और सफलता की एक उच्च दर के साथ वयस्क चूहों में एक बहुत लंबे समय तक चलने एलटीपी रिकॉर्ड करने की अनुमति देता है. पीप्रेरित एलटीपी की hysiological आधार सावधानी से जाँच की और 14 का प्रदर्शन किया गया था. इस पद्धति को पत्र में, हम विच्छेदन प्रक्रिया गहरा स्लाइस उत्तेजना को संशोधित कर सकता है, जबकि तापमान या ऑक्सीजन की तरह प्रयोगात्मक शर्तों के किसी भी संशोधन, एलटीपी रखरखाव पर एक गहरा प्रभाव हो सकता है. यह भी इन सभी मापदंडों का सटीक नियंत्रण नौसिखिए छात्रों के लिए कई महीनों की प्रशिक्षण की आवश्यकता पर जोर दिया जाना चाहिए.
Protocol
Representative Results
Discussion
हम अपनी प्रयोगशाला में विकसित और एलटीपी रिकॉर्डिंग 11,17 में एक बड़ा विशेषज्ञता वाले अन्य प्रयोगशालाओं द्वारा इस्तेमाल के तरीकों के संयोजन से उत्पन्न एक प्रोटोकॉल विकसित किया है. इस प्रोटोकॉल वयस्…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम तकनीकी सहायता के लिए बर्नार्ड Foucart धन्यवाद. इस काम के वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए बेल्जियम फंड (FRS-FNRS) द्वारा और चिकित्सा अनुसंधान के लिए महारानी एलिजाबेथ कोष द्वारा समर्थित किया गया था. एग्नेस Villers वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए बेल्जियम के फंड पर रिसर्च फैलो है.
Materials
| Reagent/Material | |||
| NaCl | Sigma – Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma – Aldrich | S8875 | |
| KCl | Sigma – Aldrich | P9333 | |
| D-glucose | Sigma – Aldrich | G7528 | |
| NaH2PO4 | Sigma – Aldrich | S9638 | |
| MgSO4 1M | Sigma – Aldrich | 63126 | |
| CaCl2 | Sigma – Aldrich | C4901 | |
| Carbogen | Air Liquide (Belgium) | ||
| Capillaries | WPI, Inc. (UK) | TW150-4 | |
| Stimulating Electrodes | FHC (USA) | CE2B30 | |
| Surgical tools | FST (Germany) | ||
| Filter paper 84 g/m2 | Sartorius | FT-3-105-110 | |
| Mesh | Lycra | 15 den | |
| Glue | UHU | plus endfest300 | |
| Instrument | |||
| Amplifier | WPI, Inc. (UK) | ISO-80 | |
| Interface recording chamber | FST (Germany) | ||
| Peristaltic pumps | Gilson (USA) | Minipuls 3 | |
| Temperature controller | University of Edinburgh | www.etcsystem.com | |
| Tissue Chopper | Mcllwain | ||
| Stimulators | Grass (USA) | S88X + SIU-V | |
| Program analysis | WinLTP | www.winltp.com | |
| Micromanipulators | Narishige | MM-3 and MMO-220A | |
| Surgical microscope | Leica Microsystem | ||
| A/D converter | National Instruments | NIPCI-6229 M-series |
Referências
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