Forbedret Utarbeidelse og Bevaring av hippocampus Mouse Slices for en meget stabil og reproduserbar Recording of Long-term Potensiering
Summary
Dette notatet presenterer en komplett metodikk for å forberede og bevare<em> In vitro</em> Akutte hippocampus skiver fra voksne mus. Denne protokollen tillater opptak av meget stabil langvarig langsiktig (LTP) for mer enn åtte timer med en suksessrate på 95%.
Abstract
Long-term (LTP) er en type av synaptisk plastisitet karakterisert ved en økning av synaptiske styrke og antas å være involvert i minnet koding. LTP lyttes til ved CA1 regionen akutte hippocampus skiver har blitt grundig studert. Men de molekylære mekanismene bak vedlikeholdsfasen av dette fenomenet er fortsatt dårlig forstått. Dette kan delvis skyldes de forskjellige anvendte forsøksbetingelser ved forskjellige laboratorier. Faktisk er vedlikeholdsfasen av LTP sterkt avhengig av eksterne parametere som oksygen, temperatur og luftfuktighet. Det er også avhengig av interne parametere som orientering av flyet og kutting skive levedyktighet etter disseksjon.
Optimaliseringen av alle disse parametrene muliggjør induksjon av en meget reproduserbar, og veldig stabil langtidspotensiering. Denne metodikken gir mulighet for ytterligere å utforske de molekylære mekanismene som er involvert i stabil økningi synaptiske styrken i hippocampus skiver. Det understreker også betydningen av eksperimentelle forhold i in vitro undersøkelse av nevrofysiologiske fenomener.
Introduction
I dag er det begrenset forståelse av hvordan komplekse minner lagres og hentes frem ved neuronal krets nivå. Imidlertid er en samlende hypotese av lagringsenheter tilgjengelig og bredt akseptert: minner er lagret som endringer i styrken av synaptiske forbindelser mellom nevroner i sentralnervesystemet. På sin egen, har forskning på synaptisk plastisitet i stor grad dratt nytte av to banebrytende oppdagelser. (1) I et banebrytende eksperiment, Bliss og Lomo en, ved hjelp av intakt bedøvet kanin, fant at levering av en kort høyfrekvente (1 sek, 100 Hz) stimulering til perforant banen til hippocampus forårsaket en langvarig (flere timer) øke i de relaterte synaptiske forbindelser. Denne fascinerende fenomenet ble kalt "Long-Term Potensiering" eller LTP av Douglas og Goddard i 1975 2. (2) Senere ble det funnet at et lignende fenomen kan utløses i hjernen skiver (0,4 mm) kunstig opprettholdt i live in vitro </em>. Den mest studerte LTP ble observert in vitro ved å levere ett eller flere tetani til en bunt av aksoner (de såkalte Schaffer kollateraler) ved opptak av det resulterende feltet eksitatorisk synaptisk potensial fremkalt i de pyramidale neuroner i den såkalte CA1 regionen. Mekanismene for LTP induksjon har i stor grad blitt avslørt. I utgangspunktet aktiverer en Ca 2 + tilstrømning gjennom NMDA reseptorer enzymer med to konsekvenser: en fosforylering av AMPA reseptorer (som øker deres effektivitet) og en inkorporering av ekstra AMPA reseptorer i den postsynaptiske membranen tre. I motsetning til mekanismene i vedlikeholdsfasen av LTP er stort sett ukjent, særlig fordi det er eksperimentelt mye mer vanskelig å opprettholde en sunn skive i mange timer enn i 30 til 60 min.
Mange studier har vært dedikert til forståelsen av LTP mekanismer og interessante teorier har blitt utarbeidet i løpet av årene 4-11. Men until nå, har de nøyaktige molekylære mekanismene bak stabil økning i synaptiske styrken ikke klarlagt. Dette kan være delvis på grunn av problemer med å reprodusere tidligere resultater i forskjellige laboratorier bruker ulike teknikker for utarbeidelse og vedlikehold av hippocampus skiver. I sin metodikk papir, understreket Sajikumar et al. 12. viktigheten av eksperimentelle betingelser for utarbeidelse av rotte hippocampus skiver og registrering av stabil LTP. I denne videoen presenterer vi alle optimalisering trinn utviklet i vårt laboratorium gjennom årene for å kunne registrere en meget stabil LTP i mus hippocampus skiver.
Denne optimaliseringen har blitt gjort fra protokoller utviklet og brukt av andre laboratorier som studerer LTP mekanismer i mus 13 og rotter 11. Den lar erfarne forskere til å indusere og registrere en svært langvarig LTP i voksen mus med en høy grad av suksess. Den physiological grunnlag av den induserte LTP ble nøye kontrollert og demonstrerte 14. I denne metodikken papir, viser vi at eventuelle modifikasjoner av eksperimentelle forhold, som temperatur eller oksygentilførsel kan ha stor innvirkning på LTP vedlikehold mens disseksjon prosedyren kan dypt endre skiver oppstemthet. Det må også understrekes at presis kontroll over alle disse parameterne krever en opplæring av flere måneder for uerfarne studenter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har utviklet i vårt laboratorium en protokoll som følge av en kombinasjon av metoder utviklet og brukes av andre laboratorier har en stor kompetanse i LTP opptak 11,17. Denne protokollen er innrettet til voksen mus hippocampus, og kan brukes på dyr av enhver alder og bakgrunns-genotype. Den gjør også analyse av LTP i transgene mus utvikler nevrodegenerative sykdommer som Alzheimers sykdom 18,19.
Utnyttelse av denne protokollen for rotte hippocampus skiver kan n?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Bernard Foucart for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av den belgiske Fund for Scientific Research (FRS-FNRS) og ved Queen Elisabeth fond for medisinsk forskning. Agnès Villers er stipendiat ved den belgiske Fund for Scientific Research.
Materials
| Reagent/Material | |||
| NaCl | Sigma – Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma – Aldrich | S8875 | |
| KCl | Sigma – Aldrich | P9333 | |
| D-glucose | Sigma – Aldrich | G7528 | |
| NaH2PO4 | Sigma – Aldrich | S9638 | |
| MgSO4 1M | Sigma – Aldrich | 63126 | |
| CaCl2 | Sigma – Aldrich | C4901 | |
| Carbogen | Air Liquide (Belgium) | ||
| Capillaries | WPI, Inc. (UK) | TW150-4 | |
| Stimulating Electrodes | FHC (USA) | CE2B30 | |
| Surgical tools | FST (Germany) | ||
| Filter paper 84 g/m2 | Sartorius | FT-3-105-110 | |
| Mesh | Lycra | 15 den | |
| Glue | UHU | plus endfest300 | |
| Instrument | |||
| Amplifier | WPI, Inc. (UK) | ISO-80 | |
| Interface recording chamber | FST (Germany) | ||
| Peristaltic pumps | Gilson (USA) | Minipuls 3 | |
| Temperature controller | University of Edinburgh | www.etcsystem.com | |
| Tissue Chopper | Mcllwain | ||
| Stimulators | Grass (USA) | S88X + SIU-V | |
| Program analysis | WinLTP | www.winltp.com | |
| Micromanipulators | Narishige | MM-3 and MMO-220A | |
| Surgical microscope | Leica Microsystem | ||
| A/D converter | National Instruments | NIPCI-6229 M-series |
Referências
- Bliss, T. V., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J. Physiol. 232 (2), 331-356 (1973).
- Douglas, R. M., Goddard, G. V. Long-term potentiation of the perforant path-granule cell synapse in the rat hippocampus. Brain Res. 86, 205-215 (1975).
- Squire, L., Kandel, E. . Memory: From mind to molecules. , (1999).
- Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP. Science. 265 (5175), 1104-1107 (1994).
- Frey, U., Morris, R. G. Synaptic tagging and long-term potentiation. Nature. 385 (6616), 533-536 (1038).
- Bortolotto, Z. A., Collingridge, G. L. A role for protein kinase C in a form of metaplasticity that regulates the induction of long-term potentiation at CA1 synapses of the adult rat hippocampus. Eur. J. Neurosci. 12 (11), 4055-4062 (2000).
- Migues, P. V., Hardt, O., et al. PKMzeta maintains memories by regulating GluR2-dependent AMPA receptor trafficking. Nat. Neurosci. 13 (5), 630-634 (2010).
- Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. -. C., Choquet, D. Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity. Neuron. 54 (3), 447-460 (2007).
- Vickers, C. A., Dickson, K. S., Wyllie, D. J. A. Induction and maintenance of late-phase long-term potentiation in isolated dendrites of rat hippocampal CA1 pyramidal neurones. J. Physiol. 568 (3), 803-813 (2005).
- Fonseca, R. Activity-dependent actin dynamics are required for the maintenance of long-term plasticity and for synaptic capture. Eur. J. Neurosci. 35 (2), 195-206 (2012).
- Redondo, R. L., Okuno, H., Spooner, P. A., Frenguelli, B. G., Bito, H., Morris, R. G. M. Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation. J. Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).
- Sajikumar, S., Navakkode, S., Frey, J. U. Protein synthesis-dependent long-term functional plasticity: methods and techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 15 (5), 607-613 (2005).
- Connor, S. A., Wang, Y. T., Nguyen, P. V. Activation of beta-adrenergic receptors facilitates heterosynaptic translation-dependent long-term potentiation. J. Physiol. 589 (17), 4321-4340 (2011).
- Villers, A., Godaux, E., Ris, L. Long-lasting LTP requires neither repeated trains for its induction nor protein synthesis for its development. PLoS One. 7 (7), e40823 (2012).
- Capron, B., Sindic, C., Godaux, E., Ris, L. The characteristics of LTP induced in hippocampal slices are dependent on slice-recovery conditions. Learn. Mem. 13 (3), 271-277 (2006).
- Villers, A., Godaux, E., Ris, L. Late phase of L-LTP elicited in isolated CA1 dendrites cannot be transferred by synaptic capture. Neuroreport. 21, 210-215 (2010).
- Nguyen, P. V., Kandel, E. R. Brief theta-burst stimulation induces a transcription-dependent late phase of LTP requiring cAMP in area CA1 of the mouse hippocampus. Learn. Mem. 4 (2), 230-243 (1997).
- Dewachter, I., Ris, L., et al. Modulation of synaptic plasticity and Tau phosphorylation by wild-type and mutant presenilin1. Neurobiol. Aging. 29 (5), 639-652 (2008).
- Dewachter, I., Filipkowski, R. K., et al. Deregulation of NMDA-receptor function and down-stream signaling in APP[V717I] transgenic mice. Neurobiol. Aging. 30 (2), 241-256 (2009).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology. J. Vis. Exp. (49), e2330 (2011).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J. Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).
- Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity. Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).
- Alger, B. E., Dhanjal, S. S., Dingledine, R., Garthwaite, J., Henderson, G., King, G. L., Dingledine, R., et al. Appendix: Brain slice methods. Brain Slices. , 381-437 (1984).
- Watson, P. L., Weiner, J. L., Carlen, P. L. Effects of variations in hippocampal slice preparation protocol on the electrophysiological stability, epileptogenicity and graded hypoxia responses of CA1 neurons. Brain Res. 775, 134-143 (1997).
- Frey, U., Krug, M., Reymann, K. G., Matthies, H. Anisomycin, an inhibitor of protein synthesis, blocks late phases of LTP phenomena in the hippocampal CA1 region in vitro. Brain Res. 452 (1-2), 57-65 (1988).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Fonseca, R., Nägerl, U. V., Bonhoeffer, T. Neuronal activity determines the protein synthesis dependence of long-term potentiation. Nat. Neurosci. 9 (4), 478-480 (2006).
- Rudy, J. W. Is there a baby in the bathwater? Maybe: some methodological issues for the de novo protein synthesis hypothesis. Neurobiol. Learn. Mem. 89 (3), 219-224 (2008).
- Sharma, A. V., Nargang, F. E., Dickson, C. T. Neurosilence: Profound Suppression of Neural Activity following Intracerebral Administration of the Protein Synthesis Inhibitor Anisomycin. J. Neurosci. 32 (7), 2377-2387 (2012).
- Volianskis, A., Jensen, M. S. Transient and sustained types of long-term potentiation in the CA1 area of the rat hippocampus. J. Physiol. 550 (2), 459-492 (2003).
- Ris, L., Villers, A., Godaux, E. Synaptic capture-mediated long-lasting long-term potentiation is strongly dependent on mRNA translation. Neuroreport. 20 (17), 1572-1576 (2009).
- Abbas, A. -. K., Dozmorov, M., et al. Persistent LTP without triggered protein synthesis. Neurosci. Res. 63 (1), 59-65 (2009).
- Ho, O. H., Delgado, J. Y., O’Dell, T. J. Phosphorylation of proteins involved in activity-dependent forms of synaptic plasticity is altered in hippocampal slices maintained in vitro. J. Neurochem. 91, 1344-1357 (2004).
- Whittingham, T. S., Lust, W. D., Christakis, D. A., Passonneau, J. V. Metabolic stability of hippocampal slice preparations during prolonged incubation. J. Neurochem. 43, 689-696 (1984).
- Dunlop, D. S., van Elden, W., Lajtha, A. Optimal conditions for protein synthesis in incubated slices of rat brain. Brain Res. 99, 303-318 (1975).
- Taubenfeld, S. M., Stevens, K. A., Pollonini, G., Ruggiero, J., Alberini, C. M. Profound molecular changes following hippocampal slice preparation: loss of AMPA receptor subunits and uncoupled mRNA/protein expression. J. Neurochem. 81 (6), 1348-1360 (2002).
- Gruart, A., Munoz, M. D., Delgado-Garcia, J. M. Involvement of the CA3-CA1 synapse in the acquisition of associative learning in behaving mice. J. Neurosci. 26 (4), 1077-1087 (2006).
- Whitlock, J. R., Heynen, A. J., Shuler, M. G., Bear, M. F. Learning induces long-term potentiation in the hippocampus. Science. 313, 1093-1097 (2006).
- Grant, S. G. N., Silva, A. J. Targeting learning. TINS. 17 (2), 71-75 (1994).
- Izquierdo, I., Medina, J. H., Vianna, M. R. M., Izquierdo, L. A., Barros, B. M. Separate mechanisms for short- and long-term memory. Behav. Brain Res. 103, 1-11 (1999).
- Morice, E., Andreae, L. C., Cooke, S. F., Vanes, L., Fisher, E. M. C., Tybulewicz, V. L. J., Bliss, T. V. P. Preservation of long-term memory and synaptic plasticity despite short-term impairments in the Tc1 mouse model of Down syndrome. Learn Mem. 15 (7), 492-500 (2008).
- Dunlop, D. S., van Elden, W., Plucinska, I., Lajtha, A. Brain Slice Protein Degradation and Development. J. Neurochem. 36, 258-265 (1981).
- Izquierdo, I. Long-term potentiation and the mechanisms of memory. Drug Dev. Res. 30, 1-17 (1993).
