Улучшенная Подготовка и консервация срезов гиппокампа мышь для очень стабильный и воспроизводимый Запись Долгосрочные Потенцирования
Summary
Эта статья представляет собой полную методологию подготовить и сохранить<em> В пробирке</em> Острых срезов гиппокампа от взрослых мышей. Этот протокол позволяет записывать очень стабильный длительный долгосрочного потенцирования (LTP) более чем на 8 часов с вероятностью успеха 95%.
Abstract
Долгосрочные потенцирование (LTP) является одним из видов синаптической пластичности характеризуется увеличением в синаптической силы и полагают, вовлечены в памяти кодирование. LTP вызвала в области CA1 острых срезов гиппокампа была тщательно изучена. Однако молекулярные механизмы, лежащие в основе поддерживающей фазы этого явления еще мало изучены. Это может быть частично из-за различных экспериментальных условиях, используемых различными лабораториями. Действительно, поддерживающей фазы LTP сильно зависит от внешних параметров, таких как оксигенации, температуры и влажности. Это также зависит от внутренних параметров, как ориентация секущую плоскость среза и жизнеспособность после вскрытия.
Оптимизация всех этих параметров позволяет индукции очень воспроизводимые и очень стабильного долгосрочного потенцирования. Эта методика дает возможность для дальнейшего изучения молекулярных механизмов, вовлеченных в стабильный роств синаптической силы в срезах гиппокампа. В нем также подчеркивается важность в условиях эксперимента в пробирке исследование нейрофизиологических явлений.
Introduction
В настоящее время существует ограниченное понимание того, каким сложным воспоминания хранятся и напомнил на нейронном уровне схемы. Тем не менее, объединяющей гипотеза памяти имеется помещение для хранения и общепринятым: воспоминания хранятся в виде изменений в силу синаптических связей между нейронами в центральной нервной системе. Само по себе исследование на синаптическую пластичность в значительной степени выиграли от двух открытий прорыв. (1) В семенных эксперимента Bliss и лома 1, с использованием интактных анестезированных кроликов, обнаружил, что доставка краткого высокочастотных (1 сек, 100 Гц) стимуляции проводящие пути гиппокампа вызванные длительным (несколько часов) увеличение связанных синаптических соединений. Это увлекательное явление было названо «Долгосрочное Потенцирования» или LTP Дугласом и Годдард в 1975 году 2. (2) Позже было установлено, что аналогичное явление может быть вызвано в срезах мозга (0,4 мм) искусственно поддерживается живыми в пробирке </eм>. Наиболее широко изученных LTP наблюдалось в пробирке путем предоставления одной или нескольких спазмов в пучок аксонов (так называемый Schaffer залогов) во время записи результирующего поля возбуждающих синапсов потенциал вызывали в пирамидальных нейронов из так называемого СА1. Механизмы индукции LTP в значительной степени были выявлены. В принципе, Ca 2 + приток через NMDA рецепторы активирует ферменты с двумя последствиями: фосфорилирования АМРА (что повышает их эффективность) и включение дополнительной АМРА рецепторов в постсинаптической мембраны 3. В отличие от этого, механизмы поддерживающей фазы LTP в значительной степени неизвестны, в частности, потому, что это экспериментально гораздо труднее поддерживать здоровую часть в течение многих часов, чем от 30 до 60 мин.
Многие исследования были посвящены пониманию LTP механизмов и интересных теорий были разработаны на протяжении многих лет 4-11. Но ООНсезам теперь, точные молекулярные механизмы, лежащие в основе стабильного увеличения синаптической силы не выяснены. Это может быть частично связано с трудностью воспроизвести предыдущие результаты в разных лабораториях с использованием различных методов для подготовки и поддержания срезов гиппокампа. В своей методологии бумаге, Sajikumar соавт. +12 Подчеркнул важность экспериментальных условий для подготовки срезах гиппокампа крыс и запись стабильной LTP. В этом видео мы представить все шаги оптимизации в нашей лаборатории на протяжении многих лет, чтобы иметь возможность записать очень стабильная LTP в срезах гиппокампа мыши.
Эта оптимизация была сделана из протоколов, разработанных и успешно используется другими лабораториями, которые изучают механизмы LTP 13 у мышей и крыс 11. Это позволяет опытным исследователям, чтобы вызвать и записывать очень длительный LTP у взрослых мышей с высоким уровнем успеха. Physiological основе наведенного БПЛ тщательно проверены и продемонстрированы 14. В этой методологии работе мы показываем, что любые изменения экспериментальных условий, таких как температура или оксигенации может оказать глубокое влияние на LTP, то во вскрытии процедура может основательно изменить ломтиками возбудимости. Следует также подчеркнуть, что тщательный контроль всех этих параметров требует подготовки нескольких месяцев для начинающих студентов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы разработали в нашей лаборатории протокола в результате комбинации методов, разработанных и используемых другими лабораториях, имеющих большой опыт в записи LTP 11,17. Этот протокол адаптирован к гиппокампе взрослых мышей и могут быть использованы на животных любого возраста и ф?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Бернард Foucart за техническую помощь. Эта работа выполнена при поддержке бельгийского фонда научных исследований (FRS-FNRS) и Фондом королевы Елизаветы для медицинских исследований. Аньес Вилле является научным сотрудником Бельгийского фонда по научным исследованиям.
Materials
| Reagent/Material | |||
| NaCl | Sigma – Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma – Aldrich | S8875 | |
| KCl | Sigma – Aldrich | P9333 | |
| D-glucose | Sigma – Aldrich | G7528 | |
| NaH2PO4 | Sigma – Aldrich | S9638 | |
| MgSO4 1M | Sigma – Aldrich | 63126 | |
| CaCl2 | Sigma – Aldrich | C4901 | |
| Carbogen | Air Liquide (Belgium) | ||
| Capillaries | WPI, Inc. (UK) | TW150-4 | |
| Stimulating Electrodes | FHC (USA) | CE2B30 | |
| Surgical tools | FST (Germany) | ||
| Filter paper 84 g/m2 | Sartorius | FT-3-105-110 | |
| Mesh | Lycra | 15 den | |
| Glue | UHU | plus endfest300 | |
| Instrument | |||
| Amplifier | WPI, Inc. (UK) | ISO-80 | |
| Interface recording chamber | FST (Germany) | ||
| Peristaltic pumps | Gilson (USA) | Minipuls 3 | |
| Temperature controller | University of Edinburgh | www.etcsystem.com | |
| Tissue Chopper | Mcllwain | ||
| Stimulators | Grass (USA) | S88X + SIU-V | |
| Program analysis | WinLTP | www.winltp.com | |
| Micromanipulators | Narishige | MM-3 and MMO-220A | |
| Surgical microscope | Leica Microsystem | ||
| A/D converter | National Instruments | NIPCI-6229 M-series |
Referências
- Bliss, T. V., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J. Physiol. 232 (2), 331-356 (1973).
- Douglas, R. M., Goddard, G. V. Long-term potentiation of the perforant path-granule cell synapse in the rat hippocampus. Brain Res. 86, 205-215 (1975).
- Squire, L., Kandel, E. . Memory: From mind to molecules. , (1999).
- Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP. Science. 265 (5175), 1104-1107 (1994).
- Frey, U., Morris, R. G. Synaptic tagging and long-term potentiation. Nature. 385 (6616), 533-536 (1038).
- Bortolotto, Z. A., Collingridge, G. L. A role for protein kinase C in a form of metaplasticity that regulates the induction of long-term potentiation at CA1 synapses of the adult rat hippocampus. Eur. J. Neurosci. 12 (11), 4055-4062 (2000).
- Migues, P. V., Hardt, O., et al. PKMzeta maintains memories by regulating GluR2-dependent AMPA receptor trafficking. Nat. Neurosci. 13 (5), 630-634 (2010).
- Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. -. C., Choquet, D. Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity. Neuron. 54 (3), 447-460 (2007).
- Vickers, C. A., Dickson, K. S., Wyllie, D. J. A. Induction and maintenance of late-phase long-term potentiation in isolated dendrites of rat hippocampal CA1 pyramidal neurones. J. Physiol. 568 (3), 803-813 (2005).
- Fonseca, R. Activity-dependent actin dynamics are required for the maintenance of long-term plasticity and for synaptic capture. Eur. J. Neurosci. 35 (2), 195-206 (2012).
- Redondo, R. L., Okuno, H., Spooner, P. A., Frenguelli, B. G., Bito, H., Morris, R. G. M. Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation. J. Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).
- Sajikumar, S., Navakkode, S., Frey, J. U. Protein synthesis-dependent long-term functional plasticity: methods and techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 15 (5), 607-613 (2005).
- Connor, S. A., Wang, Y. T., Nguyen, P. V. Activation of beta-adrenergic receptors facilitates heterosynaptic translation-dependent long-term potentiation. J. Physiol. 589 (17), 4321-4340 (2011).
- Villers, A., Godaux, E., Ris, L. Long-lasting LTP requires neither repeated trains for its induction nor protein synthesis for its development. PLoS One. 7 (7), e40823 (2012).
- Capron, B., Sindic, C., Godaux, E., Ris, L. The characteristics of LTP induced in hippocampal slices are dependent on slice-recovery conditions. Learn. Mem. 13 (3), 271-277 (2006).
- Villers, A., Godaux, E., Ris, L. Late phase of L-LTP elicited in isolated CA1 dendrites cannot be transferred by synaptic capture. Neuroreport. 21, 210-215 (2010).
- Nguyen, P. V., Kandel, E. R. Brief theta-burst stimulation induces a transcription-dependent late phase of LTP requiring cAMP in area CA1 of the mouse hippocampus. Learn. Mem. 4 (2), 230-243 (1997).
- Dewachter, I., Ris, L., et al. Modulation of synaptic plasticity and Tau phosphorylation by wild-type and mutant presenilin1. Neurobiol. Aging. 29 (5), 639-652 (2008).
- Dewachter, I., Filipkowski, R. K., et al. Deregulation of NMDA-receptor function and down-stream signaling in APP[V717I] transgenic mice. Neurobiol. Aging. 30 (2), 241-256 (2009).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology. J. Vis. Exp. (49), e2330 (2011).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J. Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).
- Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity. Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).
- Alger, B. E., Dhanjal, S. S., Dingledine, R., Garthwaite, J., Henderson, G., King, G. L., Dingledine, R., et al. Appendix: Brain slice methods. Brain Slices. , 381-437 (1984).
- Watson, P. L., Weiner, J. L., Carlen, P. L. Effects of variations in hippocampal slice preparation protocol on the electrophysiological stability, epileptogenicity and graded hypoxia responses of CA1 neurons. Brain Res. 775, 134-143 (1997).
- Frey, U., Krug, M., Reymann, K. G., Matthies, H. Anisomycin, an inhibitor of protein synthesis, blocks late phases of LTP phenomena in the hippocampal CA1 region in vitro. Brain Res. 452 (1-2), 57-65 (1988).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Fonseca, R., Nägerl, U. V., Bonhoeffer, T. Neuronal activity determines the protein synthesis dependence of long-term potentiation. Nat. Neurosci. 9 (4), 478-480 (2006).
- Rudy, J. W. Is there a baby in the bathwater? Maybe: some methodological issues for the de novo protein synthesis hypothesis. Neurobiol. Learn. Mem. 89 (3), 219-224 (2008).
- Sharma, A. V., Nargang, F. E., Dickson, C. T. Neurosilence: Profound Suppression of Neural Activity following Intracerebral Administration of the Protein Synthesis Inhibitor Anisomycin. J. Neurosci. 32 (7), 2377-2387 (2012).
- Volianskis, A., Jensen, M. S. Transient and sustained types of long-term potentiation in the CA1 area of the rat hippocampus. J. Physiol. 550 (2), 459-492 (2003).
- Ris, L., Villers, A., Godaux, E. Synaptic capture-mediated long-lasting long-term potentiation is strongly dependent on mRNA translation. Neuroreport. 20 (17), 1572-1576 (2009).
- Abbas, A. -. K., Dozmorov, M., et al. Persistent LTP without triggered protein synthesis. Neurosci. Res. 63 (1), 59-65 (2009).
- Ho, O. H., Delgado, J. Y., O’Dell, T. J. Phosphorylation of proteins involved in activity-dependent forms of synaptic plasticity is altered in hippocampal slices maintained in vitro. J. Neurochem. 91, 1344-1357 (2004).
- Whittingham, T. S., Lust, W. D., Christakis, D. A., Passonneau, J. V. Metabolic stability of hippocampal slice preparations during prolonged incubation. J. Neurochem. 43, 689-696 (1984).
- Dunlop, D. S., van Elden, W., Lajtha, A. Optimal conditions for protein synthesis in incubated slices of rat brain. Brain Res. 99, 303-318 (1975).
- Taubenfeld, S. M., Stevens, K. A., Pollonini, G., Ruggiero, J., Alberini, C. M. Profound molecular changes following hippocampal slice preparation: loss of AMPA receptor subunits and uncoupled mRNA/protein expression. J. Neurochem. 81 (6), 1348-1360 (2002).
- Gruart, A., Munoz, M. D., Delgado-Garcia, J. M. Involvement of the CA3-CA1 synapse in the acquisition of associative learning in behaving mice. J. Neurosci. 26 (4), 1077-1087 (2006).
- Whitlock, J. R., Heynen, A. J., Shuler, M. G., Bear, M. F. Learning induces long-term potentiation in the hippocampus. Science. 313, 1093-1097 (2006).
- Grant, S. G. N., Silva, A. J. Targeting learning. TINS. 17 (2), 71-75 (1994).
- Izquierdo, I., Medina, J. H., Vianna, M. R. M., Izquierdo, L. A., Barros, B. M. Separate mechanisms for short- and long-term memory. Behav. Brain Res. 103, 1-11 (1999).
- Morice, E., Andreae, L. C., Cooke, S. F., Vanes, L., Fisher, E. M. C., Tybulewicz, V. L. J., Bliss, T. V. P. Preservation of long-term memory and synaptic plasticity despite short-term impairments in the Tc1 mouse model of Down syndrome. Learn Mem. 15 (7), 492-500 (2008).
- Dunlop, D. S., van Elden, W., Plucinska, I., Lajtha, A. Brain Slice Protein Degradation and Development. J. Neurochem. 36, 258-265 (1981).
- Izquierdo, I. Long-term potentiation and the mechanisms of memory. Drug Dev. Res. 30, 1-17 (1993).
