Förbättrad bearbetning och konservering av hippocampus Mouse skivor för en mycket stabil och reproducerbar Inspelning av långsiktig potentiering
Summary
Denna uppsats presenterar en komplett metodik för att förbereda och bevara<em> In vitro</em> Akut hippocampus skivor från vuxna möss. Detta protokoll möjliggör inspelning av mycket stabil långvarig långsiktig potentiering (LTP) för mer än 8 timmar med en framgång på 95%.
Abstract
Långsiktig potentiering (LTP) är en typ av synaptisk plasticitet som kännetecknas av en ökning av synaptisk styrka och tros vara inblandade i minnet kodning. LTP framkallas i CA1 regionen akut hippocampus skivor har utförligt studerats. Men de molekylära mekanismerna bakom underhållsfasen av detta fenomen är fortfarande dåligt kända. Detta kan delvis bero på de olika experimentella betingelser som används av olika laboratorier. I själva verket är underhållsfasen av LTP starkt beroende av externa parametrar såsom syresättning, temperatur och fuktighet. Det är också beroende av interna parametrar såsom orientering av skivning planet och skiva viabilitet efter dissekering.
Optimeringen av alla dessa parametrar möjliggör induktion av en mycket reproducerbar och mycket stabil långsiktig potentiering. Denna metod ger möjlighet att ytterligare utforska de molekylära mekanismer som är inblandade i den stabila ökningeni synaptisk styrka i hippocampus skivor. Det belyser också vikten av experimentella förhållanden i in vitro-undersökning av neurofysiologiska fenomen.
Introduction
Numera finns begränsad förståelse för hur komplexa minnen lagras och hämtas på neuronal krets nivå. Dock är en enande hypotes minne lagringsutrymme och allmänt accepterade: minnen lagras som förändringar i styrkan av synaptiska kopplingar mellan nervceller i det centrala nervsystemet. På egen hand, har forskningen på synaptisk plasticitet gynnades i hög grad från två genombrottupptäckter. (1) I ett banbrytande experiment, Bliss och Lomo 1, med intakta nedsövda kaniner, fann att leveransen av en kort högfrekvent (1 sek, 100 Hz) stimulans till perforanta banan av hippocampus orsakade en långvarig (flera timmar) ökar i de relaterade synapsförbindelser. Denna fascinerande fenomen kallades "långsiktig potentiering" eller LTP av Douglas och Goddard 1975 2. (2) Senare visade det sig att ett liknande fenomen skulle kunna utlösas i hjärnan skivor (0,4 mm) på konstgjord väg hålls vid liv in vitro </em>. Den mest studerade LTP observerades in vitro genom att leverera en eller flera tetani till en bunt axoner (de så kallade Schaffer säkerheter) under inspelning det resulterande fältet excitatoriska synaptiska potentialen dryftats i de pyramidala nervceller av den så kallade CA1 region. Mekanismerna för LTP induktion har i stor utsträckning visat. I grund och botten, aktiverar en Ca2 + inflöde via NMDA-receptorerna enzymer med två konsekvenser: en fosforylering av AMPA-receptorer (vilket ökar deras effektivitet) och en inkorporering av extra AMPA receptorer i det postsynaptiska membranet 3. Däremot mekanismerna i underhållsfasen av LTP är till stor del okänd, i synnerhet som det är experimentellt mycket svårare att upprätthålla ett segment hälsosamt för många timmar än under 30 till 60 min.
Många studier har ägnats åt förståelsen av LTP mekanismer och intressanta teorier har utarbetats under åren 4-11. Men until nu, har de exakta molekylära mekanismerna bakom den stabila ökningen av synaptisk styrka inte klarlagts. Detta kan delvis bero på svårigheten att reproducera tidigare resultat i olika laboratorier med olika tekniker för framställning och underhåll av hippocampus skivor. I sin metodik papper, betonade Sajikumar et al. 12 vikten av experimentella betingelser för framställning av råtta hippocampus skivor och inspelning av stabil LTP. I denna video presenterar vi alla optimering steg utvecklats i vårt laboratorium under åren för att kunna spela en mycket stabil LTP i mus hippocampus skivor.
Denna optimering har gjorts av protokoll som utvecklats och använts med framgång av andra laboratorier som studerar LTP mekanismer hos möss 13 och råttor 11. Det låter erfarna forskare att framkalla och spela en mycket långvarig LTP i vuxna möss med en hög grad av framgång. Den physiological grundval av den inducerade LTP kontrolleras noggrant och visade 14. I denna metod papper, visar vi att eventuella ändringar av experimentella förhållanden, som temperatur eller syresättning kan ha en djupgående inverkan på LTP underhåll medan dissektion förfarandet kan djupt modifiera skivor retbarhet. Det måste också understrykas att exakt kontroll av alla dessa parametrar krävs en utbildning på flera månader för nybörjare studenter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har utvecklats i vårt laboratorium ett protokoll till följd av kombinationen av metoder som utvecklats och används av andra laboratorier som har en stor kompetens inom LTP inspelningar 11,17. Detta protokoll är anpassad till vuxen mus hippocampus och kan användas i djur i alla åldrar och någon bakgrund genotyp. Det gör också en analys av LTP i transgena möss utvecklar neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers sjukdom 18,19.
Utnyttjande av detta protokoll f…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Bernard Foucart för tekniskt bistånd. Detta arbete stöddes av den belgiska fonden för vetenskaplig forskning (FRS-FNRS) och av drottning Elisabeth fond för medicinsk forskning. Agnès Villers är Research Fellow vid den belgiska fonden för vetenskaplig forskning.
Materials
| Reagent/Material | |||
| NaCl | Sigma – Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma – Aldrich | S8875 | |
| KCl | Sigma – Aldrich | P9333 | |
| D-glucose | Sigma – Aldrich | G7528 | |
| NaH2PO4 | Sigma – Aldrich | S9638 | |
| MgSO4 1M | Sigma – Aldrich | 63126 | |
| CaCl2 | Sigma – Aldrich | C4901 | |
| Carbogen | Air Liquide (Belgium) | ||
| Capillaries | WPI, Inc. (UK) | TW150-4 | |
| Stimulating Electrodes | FHC (USA) | CE2B30 | |
| Surgical tools | FST (Germany) | ||
| Filter paper 84 g/m2 | Sartorius | FT-3-105-110 | |
| Mesh | Lycra | 15 den | |
| Glue | UHU | plus endfest300 | |
| Instrument | |||
| Amplifier | WPI, Inc. (UK) | ISO-80 | |
| Interface recording chamber | FST (Germany) | ||
| Peristaltic pumps | Gilson (USA) | Minipuls 3 | |
| Temperature controller | University of Edinburgh | www.etcsystem.com | |
| Tissue Chopper | Mcllwain | ||
| Stimulators | Grass (USA) | S88X + SIU-V | |
| Program analysis | WinLTP | www.winltp.com | |
| Micromanipulators | Narishige | MM-3 and MMO-220A | |
| Surgical microscope | Leica Microsystem | ||
| A/D converter | National Instruments | NIPCI-6229 M-series |
Referências
- Bliss, T. V., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J. Physiol. 232 (2), 331-356 (1973).
- Douglas, R. M., Goddard, G. V. Long-term potentiation of the perforant path-granule cell synapse in the rat hippocampus. Brain Res. 86, 205-215 (1975).
- Squire, L., Kandel, E. . Memory: From mind to molecules. , (1999).
- Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP. Science. 265 (5175), 1104-1107 (1994).
- Frey, U., Morris, R. G. Synaptic tagging and long-term potentiation. Nature. 385 (6616), 533-536 (1038).
- Bortolotto, Z. A., Collingridge, G. L. A role for protein kinase C in a form of metaplasticity that regulates the induction of long-term potentiation at CA1 synapses of the adult rat hippocampus. Eur. J. Neurosci. 12 (11), 4055-4062 (2000).
- Migues, P. V., Hardt, O., et al. PKMzeta maintains memories by regulating GluR2-dependent AMPA receptor trafficking. Nat. Neurosci. 13 (5), 630-634 (2010).
- Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. -. C., Choquet, D. Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity. Neuron. 54 (3), 447-460 (2007).
- Vickers, C. A., Dickson, K. S., Wyllie, D. J. A. Induction and maintenance of late-phase long-term potentiation in isolated dendrites of rat hippocampal CA1 pyramidal neurones. J. Physiol. 568 (3), 803-813 (2005).
- Fonseca, R. Activity-dependent actin dynamics are required for the maintenance of long-term plasticity and for synaptic capture. Eur. J. Neurosci. 35 (2), 195-206 (2012).
- Redondo, R. L., Okuno, H., Spooner, P. A., Frenguelli, B. G., Bito, H., Morris, R. G. M. Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation. J. Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).
- Sajikumar, S., Navakkode, S., Frey, J. U. Protein synthesis-dependent long-term functional plasticity: methods and techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 15 (5), 607-613 (2005).
- Connor, S. A., Wang, Y. T., Nguyen, P. V. Activation of beta-adrenergic receptors facilitates heterosynaptic translation-dependent long-term potentiation. J. Physiol. 589 (17), 4321-4340 (2011).
- Villers, A., Godaux, E., Ris, L. Long-lasting LTP requires neither repeated trains for its induction nor protein synthesis for its development. PLoS One. 7 (7), e40823 (2012).
- Capron, B., Sindic, C., Godaux, E., Ris, L. The characteristics of LTP induced in hippocampal slices are dependent on slice-recovery conditions. Learn. Mem. 13 (3), 271-277 (2006).
- Villers, A., Godaux, E., Ris, L. Late phase of L-LTP elicited in isolated CA1 dendrites cannot be transferred by synaptic capture. Neuroreport. 21, 210-215 (2010).
- Nguyen, P. V., Kandel, E. R. Brief theta-burst stimulation induces a transcription-dependent late phase of LTP requiring cAMP in area CA1 of the mouse hippocampus. Learn. Mem. 4 (2), 230-243 (1997).
- Dewachter, I., Ris, L., et al. Modulation of synaptic plasticity and Tau phosphorylation by wild-type and mutant presenilin1. Neurobiol. Aging. 29 (5), 639-652 (2008).
- Dewachter, I., Filipkowski, R. K., et al. Deregulation of NMDA-receptor function and down-stream signaling in APP[V717I] transgenic mice. Neurobiol. Aging. 30 (2), 241-256 (2009).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology. J. Vis. Exp. (49), e2330 (2011).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J. Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).
- Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity. Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).
- Alger, B. E., Dhanjal, S. S., Dingledine, R., Garthwaite, J., Henderson, G., King, G. L., Dingledine, R., et al. Appendix: Brain slice methods. Brain Slices. , 381-437 (1984).
- Watson, P. L., Weiner, J. L., Carlen, P. L. Effects of variations in hippocampal slice preparation protocol on the electrophysiological stability, epileptogenicity and graded hypoxia responses of CA1 neurons. Brain Res. 775, 134-143 (1997).
- Frey, U., Krug, M., Reymann, K. G., Matthies, H. Anisomycin, an inhibitor of protein synthesis, blocks late phases of LTP phenomena in the hippocampal CA1 region in vitro. Brain Res. 452 (1-2), 57-65 (1988).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Fonseca, R., Nägerl, U. V., Bonhoeffer, T. Neuronal activity determines the protein synthesis dependence of long-term potentiation. Nat. Neurosci. 9 (4), 478-480 (2006).
- Rudy, J. W. Is there a baby in the bathwater? Maybe: some methodological issues for the de novo protein synthesis hypothesis. Neurobiol. Learn. Mem. 89 (3), 219-224 (2008).
- Sharma, A. V., Nargang, F. E., Dickson, C. T. Neurosilence: Profound Suppression of Neural Activity following Intracerebral Administration of the Protein Synthesis Inhibitor Anisomycin. J. Neurosci. 32 (7), 2377-2387 (2012).
- Volianskis, A., Jensen, M. S. Transient and sustained types of long-term potentiation in the CA1 area of the rat hippocampus. J. Physiol. 550 (2), 459-492 (2003).
- Ris, L., Villers, A., Godaux, E. Synaptic capture-mediated long-lasting long-term potentiation is strongly dependent on mRNA translation. Neuroreport. 20 (17), 1572-1576 (2009).
- Abbas, A. -. K., Dozmorov, M., et al. Persistent LTP without triggered protein synthesis. Neurosci. Res. 63 (1), 59-65 (2009).
- Ho, O. H., Delgado, J. Y., O’Dell, T. J. Phosphorylation of proteins involved in activity-dependent forms of synaptic plasticity is altered in hippocampal slices maintained in vitro. J. Neurochem. 91, 1344-1357 (2004).
- Whittingham, T. S., Lust, W. D., Christakis, D. A., Passonneau, J. V. Metabolic stability of hippocampal slice preparations during prolonged incubation. J. Neurochem. 43, 689-696 (1984).
- Dunlop, D. S., van Elden, W., Lajtha, A. Optimal conditions for protein synthesis in incubated slices of rat brain. Brain Res. 99, 303-318 (1975).
- Taubenfeld, S. M., Stevens, K. A., Pollonini, G., Ruggiero, J., Alberini, C. M. Profound molecular changes following hippocampal slice preparation: loss of AMPA receptor subunits and uncoupled mRNA/protein expression. J. Neurochem. 81 (6), 1348-1360 (2002).
- Gruart, A., Munoz, M. D., Delgado-Garcia, J. M. Involvement of the CA3-CA1 synapse in the acquisition of associative learning in behaving mice. J. Neurosci. 26 (4), 1077-1087 (2006).
- Whitlock, J. R., Heynen, A. J., Shuler, M. G., Bear, M. F. Learning induces long-term potentiation in the hippocampus. Science. 313, 1093-1097 (2006).
- Grant, S. G. N., Silva, A. J. Targeting learning. TINS. 17 (2), 71-75 (1994).
- Izquierdo, I., Medina, J. H., Vianna, M. R. M., Izquierdo, L. A., Barros, B. M. Separate mechanisms for short- and long-term memory. Behav. Brain Res. 103, 1-11 (1999).
- Morice, E., Andreae, L. C., Cooke, S. F., Vanes, L., Fisher, E. M. C., Tybulewicz, V. L. J., Bliss, T. V. P. Preservation of long-term memory and synaptic plasticity despite short-term impairments in the Tc1 mouse model of Down syndrome. Learn Mem. 15 (7), 492-500 (2008).
- Dunlop, D. S., van Elden, W., Plucinska, I., Lajtha, A. Brain Slice Protein Degradation and Development. J. Neurochem. 36, 258-265 (1981).
- Izquierdo, I. Long-term potentiation and the mechanisms of memory. Drug Dev. Res. 30, 1-17 (1993).
