Levende Cell Imaging af Early Autophagy begivenheder: Omegasomes and Beyond
Summary
Time-lapse mikroskopi af fluorescens-mærkede autophagy markører muligt at overvåge den dynamiske autophagy respons med høj tidslig opløsning. Ved hjælp af konkrete autophagy og organel markører i en kombination af 3 forskellige farver, kan vi følge det bidrag af et protein til autophagosome dannelse i en robust rumlig og tidsmæssig sammenhæng.
Abstract
Autophagy er et cellulært respons udløst af mangel på næringsstoffer, især fraværet af aminosyrer. Autophagy er defineret ved dannelsen af dobbelt membran strukturer, kaldet autophagosomes, der udskille cytoplasma, langlivede proteiner og protein aggregater, defekte organeller, samt virus eller bakterier. Autophagosomes sidst fusionere med lysosomer, der fører til hovedparten forringelse af deres indhold, med de producerede næringsstoffer bliver genbrugt tilbage til cytoplasmaet. Derfor autophagy er afgørende for cellehomeostase og dysregulering af autophagy kan føre til sygdom, især neurodegeneration, aldring og kræft.
Autophagosome dannelse er en meget omfattende proces, hvor cellerne har afsat en specifik gruppe af proteiner, kaldet kernen autofagi maskineri. Kernen autophagy maskineri er funktionelt suppleres med yderligere proteiner involveret i diverse cellulære processer, fx i membrane menneskehandel, mitokondrie-og lysosomale biologi. Koordinering af disse proteiner til dannelse og nedbrydning af autophagosomes udgør den meget dynamisk og sofistikeret respons autophagy. Levende celler gør det muligt at følge den molekylære bidrag af hver autophagy-relateret protein ned til niveauet for en enkelt autophagosome formation begivenhed og i realtid, denne teknik giver derfor en høj tidslig og rumlig opløsning.
Her bruger vi en cellelinie stabilt udtrykker GFP-DFCP1 at etablere en rumlig og tidsmæssig sammenhæng til vores analyse. DFCP1 mærker omegasomes, som er precursor strukturer fører til autophagosomes dannelse. Et protein af interesse (POI) kan mærkes med enten en rød eller cyan fluorescerende tag. Forskellige organeller, såsom ER, mitokondrier og lysosomer, er alle involveret i forskellige trin i autophagosome dannelse, og kan mærkes med en specifik tracker farvestof. Time-lapse mikroskopi AUTOPHagy i denne eksperimentelle opsætning giver oplysninger, der skal udvindes om den fjerde dimension, nemlig tid. Derfor kan vi følge bidrag POI til autophagy i tid og rum.
Introduction
Autophagy er en meget dynamisk proces, som kræver koordinering af en lang række proteiner for det endelige resultat af autophagosome dannelse 1-3. Mikroskopi er nok den teknik mest anvendte til at studere autofagi 4.. Lokaliseringen af de fleste autophagy proteiner er blevet grundigt undersøgt i fikserede celler, både ved immunofarvning de endogene proteiner og ekspression af fluorescens mærkede exogent protein. Derudover har elektronmikroskopi (EM), alene og i kombination med immuno-guld mærkning, beskrevet de fine detaljer i disse strukturer 5,6. Trods det faktum, at disse teknikker har etableret vores forståelse af autophagosome dannelse i de 3 dimensioner af rummet, har de undladt at give tilstrækkelig mængde af information om den 4. dimension – tiden. Levende cell imaging overvinder denne barriere, da det giver mulighed for at følge dannelsen af et autophagosome så tæt som muble på realtid 7.. Denne teknik blev først ansat til at studere autophagy ved Yoshimori og kolleger 8, og har været stigende grad fremover.
Time-lapse-mikroskopi indfanger lokaliseringen af IP i levende celler og over en tidsperiode. Ved at sammenholde disse oplysninger med en velkarakteriseret autophagy og / eller organel markør, kan levende cell imaging analyse sætte POI i den større rumlige og tidsmæssige sammenhæng autophagosome formation. Levende celler Analysen er baseret på den gentagne indfangning af POI lokalisering langs alle trinnene autophagosome dannelse, mens billeddannelse af fikserede celler er baseret på en enkelt capture. Derfor kan levende celler bevise bidrag POI på bestemte trin i autophagosome dannelse, mens billeddannelse af faste celler kun kan påtage sig rollen som POI, baseret på dens gennemsnitlige lokalisering i mange autophagosomes samtidigt fanget på forskellige stadier i deres lifecycle.
Selvom levende celler er en metode til høj analytisk magt, har det nogle iboende begrænsninger, som bør tages i betragtning. Først og fremmest, levende celler kræver ekspression af et eller flere eksogene fluorescensmærkede proteiner. Fluorescerende mærker tendens til at være store i størrelse, og de kan undertiden ændre adfærden af et protein grundet steriske årsager. Denne situation er endnu tydeligere for membranproteiner, som de behøver for at fungere i den begrænsede plads i 2 dimensioner membraner. Det skal bemærkes, er autophagosomes hindeagtige strukturer, og følgelig deres dannelse kræver et stort antal af membran-associerede proteiner.
Et andet sæt af problemer er forbundet med ekspressionsniveauerne af POI. I princippet bør et exogent protein udtrykkes på niveauer svarende til det endogene protein. Dette sikrer, at vigtige regulatorer af sin sub-cellulære lokalisering ikke bliver mættet, og the analysen vil være biologisk relevant. Desuden bør overekspression af autophagy proteiner undgås, som når de udtrykkes over endogene niveauer, har de tendens til at hæmme autophagy respons 9.. Omvendt bør da ekspressionsniveauerne af POI være høj nok til at tillade efter lokalisering for en god tidsrum uden foto-blegning, et kompromis må nås. Opnåelse af optimale ekspressionsniveauer af et eksogent protein i pattedyr celler kræver en masse finjustering, men det kan lade sig gøre ved at etablere og screening cellelinjer stabilt udtrykker forskellige niveauer i POI.
Den rumlige opløsning, der kan opnås med standard fluorescensmikroskopi er en anden begrænsende faktor. Opløsning kan begrænses af en række årsager, men i bedste fald vil lateral opløsning være omkring 250 nm. Dette betyder, at genstande med en indbyrdes afstand mindre end dette vil forekomme tilsluttet (eller som en enkeltobjekt) og objekter mindre end 250 nm, vil blive repræsenteret i billedet større, end de faktisk er. Derfor billederne altid bør fortolkes med dette i tankerne og supplerende teknikker såsom EM vil være forpligtet til at løse fine ultra-strukturel detalje.
Endelig levende celler selv kræver eksponere en celle for lys, muligvis for en længere periode. Dette kan ændre de fysiologiske reaktioner i en celle, et fænomen kendt som foto-toksicitet.
Vi har med succes brugt levende celler billeddannelse af PI3P-bindende protein DFCP1 at beskrive for første gang, at autophagosomes stammer fra PI3P-rige ring-lignende strukturer betegnes omegasomes, som er i tæt samarbejde med ER tråde 10,11. Vi har klart vist, at LC3-positive strukturer begynder at danne i tæt samarbejde med omegasomes. Vi her foreslår, at ansætte en cellelinie stabilt udtrykker GFP-DFCP1 for den levende cellebilleddannelse af proteinet af interesse, etablerer en robust rumlige og tidsmæssige ramme til karakterisering af sin rolle i autophagosome formation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden i denne protokol giver mulighed for visualisering af et protein lokalisering under autophagosome formation. Vi har prøvet forskellige metoder til at visualisere begivenhederne beskrives, herunder point-konfokal, spinning disk konfokal og total intern refleksion Fluorescens (TIRF) mikroskopi. Vi har fundet, at til generelle formål standard Vidvinkelbilledet epi-fluorescens giver det bedste kompromis mellem følsomhed og opløsning. Dette sikrer god signal til støj minimal photo-bleaching/photo-toxicity og hurt…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vores arbejde er støttet af bioteknologi og biologiske Sciences Research Council. Vi vil gerne takke Prof Tamotsu Yoshimori for venligt forsyne os med plasmidet til ekspression af FFP-LC3.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 41965 | |
| OptiMEM I | Invitrogen | 31985-062 | |
| MitoTracker Red FM | Invitrogen | M22425 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L-7528 | |
| X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent | Roche Applied Science | 6365787001 | |
| 22 mm coverslips | VWR | 631-0159 | |
| 35 mm plates | Fisher NUNC | 153066 | |
| Silicon grease | RS Components Ltd. | RS 494-124 | |
| O-rings | Custom made | ||
| Attofluor Cell Chamber | Invitrogen | A-7816 | Suggested alternative to custom-made O-rings |
| Microscope | Olympus | IX81 | Inverted microscope |
| Objective | Olympus | UPLSAPO 100XO | N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5 |
| Camera | Hamamatsu | ORCA-R2 C10600 10B | Progressive scan interline CCD |
| Illuminator | TILL Photonics | Polychrome V | Ultrafast monochromator |
| Incubation chamber | Solent Scientific | Cell^R IX81 | |
| Software | Olympus | SIS xcellence |
Referências
- Mizushima, N. Autophagy: process and function. Genes Dev. 21, 2861-2873 (2007).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. The role of Atg proteins in autophagosome formation. Annual review of cell and developmental biology. 27, 107-132 (2011).
- Klionsky, D. J. Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 931-937 (2007).
- Klionsky, D. J. Autophagy revisited: a conversation with Christian de Duve. Autophagy. 4, 740-743 (2008).
- Yla-Anttilba, P., Vihinen, H., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. 3D tomography reveals connections between the phagophore and endoplasmic reticulum. Autophagy. 5, 1180-1185 (2009).
- Hayashi-Nishino, M., et al. A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome formation. Nat. Cell Biol. 11, 1433-1437 (2009).
- Lippincott-Schwartz, J. Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*). Annu. Rev. Biochem. 80, 327-332 (2011).
- Mizushima, N., et al. Dissection of autophagosome formation using Apg5-deficient mouse embryonic stem cells. The Journal of Cell Biology. 152, 657-668 (2001).
- Itakura, E., Mizushima, N. Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins. Autophagy. 6, 764-776 (2010).
- Axe, E. L., et al. Autophagosome formation from membrane compartments enriched in phosphatidylinositol 3-phosphate and dynamically connected to the endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 182, 685-701 (2008).
- Walker, S., Chandra, P., Manifava, M., Axe, E., Ktistakis, N. T. Making autophagosomes: localized synthesis of phosphatidylinositol 3-phosphate holds the clue. Autophagy. 4, 1093-1096 (2008).
