حيوي داخلي المجهري للدوران الأوعية الدقيقة في العضلات المشمرة ماوس لتحليل الهجرة الجذعية الطرفية المحمولة
Summary
intravital المجهري للالمشمرة دوران الأوعية الدقيقة الماوس M. عروض فريدة وموحدة جيدا في نموذج الجسم الحي لتحليل الطرفية نخاع العظم الخلايا الجذعية الهجرة.
Abstract
في عصر داخل الأوعية تطبيق البروتوكولات خلية في سياق العلاج بالخلايا التجدد، الآليات الكامنة وراء هجرة الخلايا الجذعية إلى أنسجة nonmarrow لم تتوضح تماما. نحن هنا وصف تقنية intravital المجهري تطبيقها على المشمرة دوران الأوعية الدقيقة الماوس لتحليل نخاع العظام الطرفية هجرة الخلايا الجذعية في الجسم الحي. intravital المجهري للM. المشمرة وقد أدخلت سابقا في مجال البحوث لالتهابات الملاحظة المباشرة للتفاعل الكرية البيضاء مع بطانة الأوعية الدموية. منذ الجذعية الطرفية كافية والسلف الخلية الهجرة يتضمن خطوات أولية مماثلة من المتداول على طول التصاق وطيد في البطانية المبطنة فمن المتصور لتطبيق نموذج المشمرة M. لرصد وتقدير حجم التفاعل بين الخلايا الجذعية تدار intravasculary مع البطانة. كما المكونات الكيميائية المختلفة يمكن تطبيقها بشكل انتقائي لر الهدفالمشكلة عن طريق تقنيات superfusion بسيطة، فمن الممكن لإنشاء شروط مسبقة microenvironmental الأساسية، للتجنيد الخلايا الجذعية الأولية لتجري في الكائن الحي خارج نخاع العظام.
Introduction
الغرض من هذه المادة هو لوصف أسلوب intravital المجهري (IVM) تطبق على المشمرة دوران الأوعية الدقيقة الماوس للمراقبة المباشرة وتحليل الطرفية نخاع العظم الخلايا الجذعية الهجرة.
المفهوم الحالي من الخلايا الجذعية استنادا الأنسجة والأعضاء التجديد ينطوي على صاروخ موجه من نخاع العظم الخلايا الجذعية المستمدة من الأنسجة المصابة 1. خطوة حاسمة لنجاح الهجرة الخلايا الجذعية يشمل وقف تفاعل الخلايا مع البطانة المحلية داخل الجهاز المصاب تليها الهجرة transendothelial وفي النهاية الجهاز engraftment 2. تحليل حيوي داخلي من هذه الخلايا الجذعية – التفاعلات الخلية البطانية يشكل معلمة مثالية لتقدير حجم استجابة التجدد الخلايا الجذعية ومقرها في إعدادات الفيزيولوجية المرضية المختلفة في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، يبدو تصور، أنه في المستقبل، وتحليل حيوي داخلي قدرة هجرة محددة ع الخلايا الجذعيةopulations ضمن بيئات الأوعية الدقيقة موحدة، يمكن تطبيقها قبل دفع هؤلاء السكان إلى مزيد من التجارب السريرية.
وقد intravital المجهري وضعت في البداية لرصد وتقدير حجم الكرية البيضاء-البطانية تفاعل الخلايا في الجسم الحي في مجال البحوث التهابات 3. ولم يبلغ عن والتسجيلات الناجحة الأولى من دراسات intravital المجهري بواسطة كونهايم بالفعل في القرن 19، ودراسة ألسنة الضفادع 'والمساريقا تحت المجهر الضوء 4. منذ أول استخدام لها IVM شهد التطور التقني الهائل واليوم بعض مكونات أساسية تشكل الشروط الأساسية من أجل أداء IVM الكمية: (ط) الاستعدادات الأنسجة التي تسمح بالوصول البصرية، (ب) تحقيقات الجزيئية التي يمكن الكشف عنها بواسطة المجهر، (ج ) المجهر متصلا نظام الكشف و (iv) تحليل النظم كمبيوتر يستند التي يمكن استخراج المعلمات من الاهتمام من بيانات الصورةضبط 4.
وقد تم عرض مجموعة متنوعة من الأعمال التحضيرية للدراسات الأنسجة بما في ذلك الإدارة المتكاملة للنواقل المساريقا وكبد الفأر والجرذ 5، غرف الظهرية ثنية الجلد من الماوس 6 والهامستر، والأذن الأرنب والقداد الخد الحقيبة على سبيل المثال لا الحصر.
ومع ذلك، في ما يلي سوف نركز على عضلة المشمرة الماوس، وهو ما يمثل الأنسجة مثالية للملاحظات حيوي داخلي، وإعداد والتصور ممكنة من خلال إجراء العمليات الجراحية موحدة بشكل جيد، وبصفة عامة أي مشاكل من التحف حركة تحدث. وقد أجريت إعداد العضلات المشمرة مفتوحة للمرة الأولى في 1970s من قبل بايز وزملاؤه 7. ووصف في الأصل للفئران، وقد تم اعتماده بنجاح أيضا في الماوس 8. بعد أن تركز أساسا على الدراسات السابقة التفاعلات الكرية البيضاء مع جدار الوعاء الدموي، وعرض مجموعتنا مؤخرا الماوس إعداد العضلات المشمرة باعتبارها valuaأداة بلي لرؤية مباشرة والتحليل الكمي من الخلايا الجذعية التفاعلات البطانة داخل المكروية تعريف 9. وقد تم دراسة مختلف المجموعات السكانية الفرعية الخلايا الجذعية باستخدام هذا النموذج، بما في ذلك الفئران ج طقم + الخلايا الجذعية نخاع العظم والخلايا الجذعية الوسيطة، وكذلك CD الإنسان الخلايا الجذعية نخاع العظم 133 + 10-12. بعد عزل الخلايا من نخاع العظام المانحة ووضع العلامات الفلورية عن التصور، يتم تطبيق انتقائي الخلايا الجذعية في دوران الأوعية الدقيقة المشمرة باستخدام حقنة الشرياني عن طريق الشريان الفخذي، وبالتالي تجنب أي فخ خلية داخل الأجهزة عن بعد. وعلاوة على ذلك، فإن النموذج العضلات المشمرة مفيد بشكل خاص منذ كيموكينات مختلف يحتمل التوسط الهجرة الخلايا الجذعية المحلية ضمن إعدادات منها، ويمكن تطبيقها موضعيا على الأنسجة المستهدفة بواسطة تقنية superfusion بسيطة.
Protocol
Representative Results
Discussion
حيوي داخلي المجهري مضان يسمح للرؤية مباشرة والتحليل الكمي من الخلايا الجذعية، البطانة التفاعلات. نموذج العضلات المشمرة مفيد بشكل خاص، لأن التعرض المجهرية وتقنيات التصور حيوي داخلي تم راسخة خلال البحوث على التفاعلات الكرية البيضاء البطانة والمكونات الكيميائية …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
| Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA) | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | C1157 |
| Rhodamine 6 G (1%) | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | 83697 |
| Ketamin (Ketanest) | Pfizer, Berlin, Germany | not available |
| Xylacin (Rompun) | Bayer, Leverkusen, Germany | not available |
| Dulbecco's Phosphate – buffered saline (PBS) | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P04-36500 |
Referências
- Madlambayan, G. J., et al. marrow stem and progenitor cell contribution to neovasculogenesis is dependent on model system with SDF-1 as a permissive trigger. Blood. 114, 4310-4319 (2009).
- Lapidot, T., Dar, A., Kollet, O. How do stem cells find their way home?. Blood. 106, 1901-1910 (2005).
- Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells. Methods Enzymol. 300, 462-481 (1999).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surg. Endosc. 17, 939-942 (2003).
- Sriramarao, P., Anderson, W., Wolitzky, B. A., Broide, D. H. Mouse bone marrow-derived mast cells roll on P-selectin under conditions of flow in vivo. Lab Invest. 74, 634-643 (1996).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).
- Bagher, P., Segal, S. S. The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation. J. Vis. Exp. , e2874 (2011).
- Kaminski, A., et al. Endothelial NOS is required for SDF-1alpha/CXCR4-mediated peripheral endothelial adhesion of c-kit+ bone marrow stem cells. Lab Invest. 88, 58-69 (2008).
- Furlani, D., et al. HMGB-1 induces c-kit+ cell microvascular rolling and adhesion via both toll-like receptor-2 and toll-like receptor-4 of endothelial cells. J. Cell Mol. Med. 16, 1094-1105 (2012).
- Furlani, D., et al. Is the intravascular administration of mesenchymal stem cells safe? Mesenchymal stem cells and intravital microscopy. Microvasc. Res. 77, 370-376 (2009).
- Donndorf, P., et al. Analysing migratory properties of human CD 133(+) stem cells in vivo after intraoperative sternal bone marrow isolation. Cell Transplant. , (2012).
