Intravitale Microscopie van de microcirculatie in de Muis cremasterspier voor de Analyse van de perifere stamcelmigratie
Summary
Intravitale microscopie van de muis M. cremaster microcirculatie biedt een unieke en goed gestandaardiseerd in vivo model voor de analyse van perifere beenmerg stamcellen migratie.
Abstract
In het tijdperk van intravasculaire celtoepassing protocollen in het kader van regeneratieve celtherapie, de onderliggende mechanismen van stamcellen migratie naar weefsel nonmarrow zijn nog niet volledig opgehelderd. We beschrijven hier de techniek van intravitale microscopie toegepast op de muis cremaster microcirculatie voor analyse van perifere beenmerg stamcellen migratie in vivo. Intravitale microscopie van M. cremaster eerder geïntroduceerd in het gebied van inflammatoire onderzoek voor directe waarneming van leukocyten interactie met het vasculaire endotheel. Aangezien voldoende perifere stamcellen en celmigratie omvat Vertaald eerste stappen van rollend en stevige adhesie aan de endotheliale voering is het denkbaar de M. cremaster model toe te passen voor waarneming en kwantificering van de interactie van intravasculary toegediende stamcellen met het endotheel. Diverse chemische componenten selectief kan worden toegepast op het doel tafgifte door eenvoudige superfusie technieken is het mogelijk om essentiële microenvironmental randvoorwaarden vast te stellen, voor de eerste stamcelrekrutering plaatsvinden in een levend organisme buiten het beenmerg.
Introduction
Het doel van dit artikel is om de techniek van het opklaren (IVM) toegepast op de muis cremaster microcirculatie voor directe observatie en analyse van perifere beenmerg stamcelmigratie beschrijven.
Het huidige concept van de stamcel gebaseerde weefsel en orgaan regeneratie betreft de homing van beenmerg afgeleide stamcellen naar het beschadigde weefsel 1. Een cruciale stap voor een succesvolle stamcelmigratie bevat stamcellen interactie met de lokale endotheel binnen de benadeelde orgel gevolgd door transendotheliale migratie en uiteindelijk orgel innesteling 2. Intravitale analyse van deze stamcellen – endotheelcelinteracties een ideaal parameter voor de kwantificering van een stamcel gebaseerde regeneratieve respons in verschillende pathofysiologische instellingen in vivo. Verder lijkt denkbaar dat in de toekomst intravitale analyse van het trekkende capaciteit specifieke stamcellen populations binnen gestandaardiseerde microcirculatie omgevingen, kunnen worden aangebracht voor het bevorderen van deze populaties aan verdere klinische testen.
Intravitale microscopie werd oorspronkelijk ontwikkeld voor waarneming en kwantificering van leukocyt-endotheelcel interacties in vivo in het gebied van inflammatoire onderzoek 3. Eerste succesvolle opnames van intravitale microscopie studies werden gemeld door Cohnheim reeds in de 19e eeuw, het bestuderen van tongen en mesenteria kikkers 'onder een lichtmicroscoop 4. Sinds zijn eerste gebruik IVM een enorme technische ontwikkeling en vandaag heeft ondergaan bepaalde essentiële componenten vormen voorwaarden om kwantitatieve IVM voeren: (i) weefsel preparaten die optische toegang mogelijk maken, (ii) moleculaire probes die kunnen worden gedetecteerd door een microscoop, (iii ) een microscoop gekoppeld aan een detectiesysteem en (iv) computer gebaseerde analysesystemen die parameters plaats kan halen uit de beelddataset 4.
Een verscheidenheid van weefsel voorbereidingen is geïntroduceerd voor IVM studies waaronder de mesenteria en de lever van de muis en rat 5, de dorsale huidplooi kamers van muis 6 en hamster, het konijn oor en de hamster wang zakje een paar te noemen.
In het volgende zullen we ons richten op de muis cremasterspier, wat een ideale weefsel voor intravitale observaties, als voorbereiding en visualisatie mogelijk door een goed gestandaardiseerde chirurgische ingreep, en in het algemeen geen problemen van bewegingsartefacten optreden. De open cremasterspier voorbereiding werd voor het eerst in de jaren 1970 gedragen door Baez en collega 7. Oorspronkelijk beschreven voor ratten, is het succes vastgesteld ook de muis 8. Na eerdere studies vooral was gericht op leukocyten interacties met de vaatwand, onze eigen groep onlangs de muis cremasterspier preparaat als waardenoriëntaties geïntroduceerdlijk hulpmiddel voor directe visualisatie en kwantitatieve analyse van stamcel-endotheel interacties binnen een gedefinieerde micro 9. Verschillende stamcel subpopulaties bestudeerd gebruikmaking dit model, zoals muizen c-kit + beenmerg stamcellen en mesenchymale stamcellen, alsook menselijke CD 133 + beenmergstamcellen 10-12. Na celisolatie van donor beenmerg en fluorescentielabelling voor visualisatie, worden de stamcellen selectief toegepast in de cremaster microcirculatie met behulp van een arteriële injectie via de slagader, waardoor elke cel beknelling binnen op afstand organen vermijden. Bovendien is de cremasterspier model is vooral handig omdat verschillende chemokines mogelijk bemiddelen lokale stamcelmigratie binnen de respectieve instellingen, kunnen worden plaatselijk door eenvoudige superfusie techniek toegepast op het te onderzoeken weefsel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Intravitale fluorescentiemicroscopie maakt directe visualisatie en kwantitatieve analyse van stamcel-endotheel interacties. De cremasterspier model is bijzonder bruikbaar, omdat blootstelling en microchirurgische technieken intravitaal visualisatie zijn goed vastgesteld tijdens het onderzoek leukocyt-endotheel interacties en diverse chemische componenten kunnen door eenvoudige superfusieapparaat techniek selectief worden toegepast op het doelweefsel. Door de afwezigheid van bewegingsartefacten en ernstige beeldrui…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
| Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA) | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | C1157 |
| Rhodamine 6 G (1%) | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | 83697 |
| Ketamin (Ketanest) | Pfizer, Berlin, Germany | not available |
| Xylacin (Rompun) | Bayer, Leverkusen, Germany | not available |
| Dulbecco's Phosphate – buffered saline (PBS) | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P04-36500 |
Referências
- Madlambayan, G. J., et al. marrow stem and progenitor cell contribution to neovasculogenesis is dependent on model system with SDF-1 as a permissive trigger. Blood. 114, 4310-4319 (2009).
- Lapidot, T., Dar, A., Kollet, O. How do stem cells find their way home?. Blood. 106, 1901-1910 (2005).
- Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells. Methods Enzymol. 300, 462-481 (1999).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surg. Endosc. 17, 939-942 (2003).
- Sriramarao, P., Anderson, W., Wolitzky, B. A., Broide, D. H. Mouse bone marrow-derived mast cells roll on P-selectin under conditions of flow in vivo. Lab Invest. 74, 634-643 (1996).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).
- Bagher, P., Segal, S. S. The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation. J. Vis. Exp. , e2874 (2011).
- Kaminski, A., et al. Endothelial NOS is required for SDF-1alpha/CXCR4-mediated peripheral endothelial adhesion of c-kit+ bone marrow stem cells. Lab Invest. 88, 58-69 (2008).
- Furlani, D., et al. HMGB-1 induces c-kit+ cell microvascular rolling and adhesion via both toll-like receptor-2 and toll-like receptor-4 of endothelial cells. J. Cell Mol. Med. 16, 1094-1105 (2012).
- Furlani, D., et al. Is the intravascular administration of mesenchymal stem cells safe? Mesenchymal stem cells and intravital microscopy. Microvasc. Res. 77, 370-376 (2009).
- Donndorf, P., et al. Analysing migratory properties of human CD 133(+) stem cells in vivo after intraoperative sternal bone marrow isolation. Cell Transplant. , (2012).
