מיקרוסקופית Intravital של זרימת הדם בשריר העכבר Cremaster לניתוח של נדידת תאי גזע היקפי
Summary
מיקרוסקופיה Intravital של זרימת דם Cremaster העכבר מ 'מציעה ייחודית וסטנדרטיזציה גם במודל vivo לניתוח נדידת תאי גזע של מח עצם היקפי.
Abstract
בעידן של פרוטוקולי יישום תא intravascular בהקשר של טיפול בתאי משובי, המנגנונים של נדידת תאי גזע לרקמות nonmarrow לא הובהרו לחלוטין. אנו מתארים כאן את הטכניקה של מיקרוסקופיה intravital להחיל את זרימת דם Cremaster עכבר לניתוח של נדידת תאי גזע היקפית מח עצם בגוף חי. מיקרוסקופיה Intravital של Cremaster מ 'כבר הציגה בעבר בתחום של מחקר דלקתי לתצפית ישירה של האינטראקציה יקוציט עם האנדותל של כלי הדם. מאז גזע היקפי מספיק ונדידת תאי אב כוללים שלבים ראשוניים דומים של מתגלגל לאורך והידבקות משרד בהאנדותל המצפה את זה מתקבל על הדעת להחיל את מודל Cremaster מ 'לתצפית וכימות של האינטראקציה של תאי גזע מנוהלים intravasculary עם האנדותל. כרכיבים כימיים שונים יכולים להיות מיושמים באופן סלקטיבי כדי לא היעדנושא על ידי טכניקות superfusion פשוט, זה אפשרי להקים תנאים מוקדמים microenvironmental חיוניים, לגיוס תאי גזע ראשוני להתקיים באורגניזם חי מחוץ למח העצם.
Introduction
מטרתו של המאמר הנוכחי היא לתאר את הטכניקה של מיקרוסקופיה intravital (IVM) להחיל על זרימת דם Cremaster עכבר להתבוננות וניתוח ישירים של נדידת תאי גזע של מח עצם היקפי.
התחדשות רקמות ואיברים המבוסס הקונספט הנוכחי של תאי גזע כרוך הביות של תאי גזע שמקורם במח עצם לרקמות נפצעו 1. צעד חיוני לנדידת תאי גזע מוצלחת כולל גזע אינטראקציה עם תא האנדותל המקומי בתוך האיבר הפצוע ואחרי הגירת transendothelial וסופו של דבר האיבר engraftment 2. ניתוח Intravital של תאי גזע אלה – אינטראקציות תא האנדותל מהווה פרמטר אידיאלי לכימות של תגובת משובי תאי גזע מבוססת בהגדרות pathophysiological שונות in vivo. יתר על כן, זה נראה מתקבל על הדעת, כי, בעתיד, ניתוח intravital של יכולת הנדידה של תאי גזע הספציפי populations בתוך סביבות microcirculatory סטנדרטיות, עשוי להיות מיושם לפני קידום אוכלוסיות אלה לבדיקה קלינית נוספת.
מיקרוסקופיה Intravital פותחה בתחילה עבור התצפית וכימות של אינטראקציה תא יקוציט-אנדותל in vivo בתחום המחקר דלקתי 3. הקלטות מוצלחות הראשונות של מחקרי מיקרוסקופיה intravital דווחו על ידי Cohnheim כבר במאה ה -19, לומדות לשון וmesenteries צפרדעים תחת מיקרוסקופ אור 4. מאז השימוש הראשון שלה IVM עבר פיתוח טכני אדיר והיום רכיבים חיוניים מסוימים יוצרים תנאים מוקדמים על מנת לבצע IVM כמותיים: הכנות (i) רקמה המאפשרות גישה אופטית, (ii) בדיקות מולקולריות שיכול להיות מזוהה על ידי מיקרוסקופ, (iii ) מיקרוסקופ המחובר למערכת גילוי וכן (iv) ניתוח מערכות מחשב מבוסס שיכול לחלץ פרמטרים של עניין מנתוני התמונהלהגדיר 4.
מגוון רחב של הכנות רקמות כבר הציג ללימודי IVM כולל mesenteries והכבד של העכבר והחולדה 5, תאי skinfold הגב של עכבר ו6 אוגר, אוזן הארנב וכיס הלחי אוגר עד כמה שם.
עם זאת, בחלק הבא אנו נתמקד בשריר Cremaster העכבר, המייצג את הרקמה אידיאלית לתצפיות intravital, כהכנה להדמיה הן אפשריות על ידי הליך כירורגי סטנדרטי היטב, ובאופן כללי אין בעיות של חפצי תנועה להתרחש. הכנת השרירים Cremaster הפתוחה בוצעה בפעם הראשונה ב1970s ידי אאז ועמיתיו 7. תאר במקור עבור חולדות, זה כבר אימץ בהצלחה גם לעכבר 8. לאחר המחקרים קודמים התמקדו בעיקר באינטראקציות יקוציט עם קיר הכלי, הקבוצה שלנו הציגה לאחרונה את הכנת השרירים Cremaster העכבר כvaluaכלי ble להדמיה ישירה וניתוח כמותי של אינטראקציות תא האנדותל גזע בתוך microenvironment מוגדר 9. אוכלוסיות תאי גזע שונות נחקרו ניצול מודל זה, כולל c-kit עכברי + בתאי גזע במח עצם ותאי גזע mesenchymal, כמו גם תקליטורי אדם תאי גזע במח עצם 133 + 10-12. בעקבות בידוד תא ממח עצם מתורם וניאון תיוג להדמיה, תאי הגזע מיושמים באופן סלקטיבי לזרימת דם Cremaster ניצול הזרקת עורקים דרך עורק הירך, ובכך להימנע מכל מלכודת תא בתוך איברים מרוחקים. יתר על כן, מודל שריר Cremaster שימושי במיוחד מאז כמוקינים שונים שעלולים להיות מתווכים נדידת תאי גזע מקומית בתוך ההגדרות המתאימות, ניתן למריחה על עור לרקמות המטרה על ידי טכניקת superfusion פשוטה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מיקרוסקופ פלואורסצנטי intravital מאפשר הדמיה ישירה וניתוח כמותי של אינטראקציות תא האנדותל גזע. מודל שריר Cremaster הוא שימושי במיוחד, שכן חשיפת microsurgical והדמית intravital טכניקות כבר מבוססת היטב במהלך המחקר על אינטראקציות יקוציט-האנדותל ורכיבים כימיים שונים יכולים להיות מיושמ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
| Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA) | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | C1157 |
| Rhodamine 6 G (1%) | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | 83697 |
| Ketamin (Ketanest) | Pfizer, Berlin, Germany | not available |
| Xylacin (Rompun) | Bayer, Leverkusen, Germany | not available |
| Dulbecco's Phosphate – buffered saline (PBS) | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P04-36500 |
Referências
- Madlambayan, G. J., et al. marrow stem and progenitor cell contribution to neovasculogenesis is dependent on model system with SDF-1 as a permissive trigger. Blood. 114, 4310-4319 (2009).
- Lapidot, T., Dar, A., Kollet, O. How do stem cells find their way home?. Blood. 106, 1901-1910 (2005).
- Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells. Methods Enzymol. 300, 462-481 (1999).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surg. Endosc. 17, 939-942 (2003).
- Sriramarao, P., Anderson, W., Wolitzky, B. A., Broide, D. H. Mouse bone marrow-derived mast cells roll on P-selectin under conditions of flow in vivo. Lab Invest. 74, 634-643 (1996).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).
- Bagher, P., Segal, S. S. The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation. J. Vis. Exp. , e2874 (2011).
- Kaminski, A., et al. Endothelial NOS is required for SDF-1alpha/CXCR4-mediated peripheral endothelial adhesion of c-kit+ bone marrow stem cells. Lab Invest. 88, 58-69 (2008).
- Furlani, D., et al. HMGB-1 induces c-kit+ cell microvascular rolling and adhesion via both toll-like receptor-2 and toll-like receptor-4 of endothelial cells. J. Cell Mol. Med. 16, 1094-1105 (2012).
- Furlani, D., et al. Is the intravascular administration of mesenchymal stem cells safe? Mesenchymal stem cells and intravital microscopy. Microvasc. Res. 77, 370-376 (2009).
- Donndorf, P., et al. Analysing migratory properties of human CD 133(+) stem cells in vivo after intraoperative sternal bone marrow isolation. Cell Transplant. , (2012).
