Ischemi-reperfusion modell av akut Kidneyskadan och efter skada Fibros i möss

Summary

Vi beskriver modeller av måttlig och svår ischemi-reperfusion-inducerad njurskada där mössen genomgår unilateral renal BLOMSTJÄLK fastspänning följt av samtidig eller fördröjd kontralateral nefrektomi, respektive. Dessa modeller ger genomgående upphov till nedsatt njurfunktion och efter skadan fibros, men skadornas svårighetsgrad och överlevnad är beroende av musen bakgrund, ålder och kirurgisk utrustning.

Abstract

Ischemi-reperfusion inducerad akut njurskada (IR-AKI) används ofta som en modell av AKI i möss, men resultaten är ofta ganska varierande med höga, ofta oredovisade dödlighet som kan förbrylla analyser. Bilateral renal BLOMSTJÄLK fastspänning används ofta för att inducera IR-AKI, men skillnaderna mellan effektiva klämma tryck och / eller renal svar på ischemi mellan njurarna leder ofta till mer varierande resultat. Dessutom är kortare klämma gånger känt att inducera mer varierande tubulär skada, och medan möss som genomgår bilateral skada med längre klämma gånger utveckla mer konsekvent tubulär skada, de dör ofta inom de första 3 dagarna efter skadan på grund av allvarlig njurinsufficiens. Att förbättra efter skada överlevnad och få mer konsekventa och förutsägbara resultat, har vi utvecklat två modeller av ensidiga ischemi-reperfusion skada följt av kontralateral nefrektomi. Båda operationer utförs med hjälp av en dorsal tillvägagångssätt, förminskande kirurgisk stress som följer fROM ventral laparotomi, som vanligen används för mus IR-AKI-operationer. För induktion av måttlig skada BALB / c-möss genomgå ensidiga fastspänning av renal BLOMSTJÄLK för 26 min och även undergå samtidig kontralateral nefrektomi. Användning av detta tillvägagångssätt, 50-60% av möss utvecklar måttlig AKI 24 h efter skada men 90-100% av mössen överlever. För att inducera mer allvarlig AKI, BALB / c möss genomgå renal pedicle fastspänning under 30 min följt av kontralateral nefrektomi 8 dagar efter skada. Detta möjliggör funktionell bedömning av renal återhämtning efter skada med 90-100% överlevnad. Tidigt efter skadan tubulär skada samt efter skada fibros är mycket konsekvent med denna modell.

Introduction

En mängd olika experimentella modeller av akut njurskada (AKI) har utvecklats för att matcha den mångfald och komplexitet av människans villkor (se referens för en ny, omfattande översyn ^1). Var och en av dessa modeller har sina egna styrkor och svagheter, och medan varje efterliknar motsvarande humana förhållanden med varierande effektivitet, ingen exakt modellera patofysiologin av sina mänskliga motsvarigheter. Ischemireperfusion (IR)-inducerad AKI har utvecklats som en modell av akut ischemi-inducerad njurskada hos gnagare. Medan allvarlighetsgrad av renal tubulär skada ses i denna modell ses sällan hos patienter med nedsatt hypoperfusion skador ^2, trots sina begränsningar och till stor del på grund av den relativt reproducerbara karaktären av denna modell, har dess omfattande användning tillhandahålls och det förväntas, kommer att fortsätta att ge viktiga insikter i många av de gemensamma grundläggande mekanismerna för AKI, reparation och terapi ^3. IR kirurgi kräver familiarity med musen njure anatomi, som vi har illustrerat i förenklad form i figur 1. Njurischemi-reperfusion (IR) skada operation kan utföras via ventrala (laparotomi) eller rygg (retroperitoneal) tillvägagångssätt. Vi använder en dorsal strategi eftersom det är mindre traumatiskt, så snabbare återhämtning och förbättrad överlevnad (särskilt när först lära proceduren). Renal IR skada kan ske ensidigt eller bilateralt. Leder dock skillnader mellan effektiva klämma tryck (som kan följa av mellanliggande perihilar fett mellan klämkäftarna) och / eller skillnader i renal svar på ischemi mellan sidorna till mer varierande resultat. Även om detta inte är ett oöverstigligt problem, kan det öka variationen mellan experiment, vilket är en viktig fråga för denna modell. Ensidig IR kan utföras med kontraindikationer lateral nefrektomi. Detta är vår metod för val eftersom det minskar variationen i fastspänning mellan pedicles, och samtidigt enllows en för att utvärdera njurfunktion, som är opåverkat med ensidig IR ensam. Det har varit diskussioner om vad som är den mest praktiska kontra optimal metod för att bedöma njurfunktionen hos möss. Urea (BUN) ger ett mått på njurfunktionen och är en användbar "första titt" markör i vissa modeller av AKI, inklusive IR skada. Däremot kan BUN nivåer påverkas av volym status av mössen som kan beröras, särskilt efter ventral tillvägagångssätt IR skada, när fördröjd återhämtning minskar oralt intag av vätska under ett antal dagar efter operationen. Serumkreatinin påverkas mindre av vätskestatus men klart påverkats av muskelmassa. En av svårigheterna med serumkreatinin mätningar har varit problem med detektion av icke-kreatinin kromogener i mus-serum med pikrinsyra tekniker. Som ett alternativ, har ett antal centra utvecklat en HPLC-metod för att kvantifiera musen kreatinin som inte påverkas av denna artefakt ^4. Emellertid UNLike BUN och pikrinsyra analyser kreatinin, vilket endast kräver 5-10 il serum, HPLC-analyser kräver ~ 25 il serum per analys, vilket om det utförs i två exemplar kommer att kräva ~ 100 pl helblod per analys. Detta kan vara begränsande för musstudier. Vissa centra har utvecklat mer känsliga HPLC och masspektrometri-baserad metoder som tillåter analys av små provvolymer ^{5, 6.} Men dessa tekniker är inte allmänt tillgängliga. En alternativ, enzymatisk kaskad analys (vilket kräver endast 5-10 il serum) har utvärderats i mus och råtta serumprover och visat att nära parallell HPLC-mätningar av serumkreatinin medan pikrinsyra analyser alltid överskattar kreatinin värden ^7. Även denna analys inte används allmänt i AKI litteraturen, är analysen kommersiellt tillgänglig, enkel att använda, och vi finner ger tillförlitliga resultat med denna modell av IR-inducerad AKI i möss.

Protocol

Autoklav alla kirurgiska instrument för kirurgi. Observera att om man utför flera operationer på olika möss, skölj instrument efter användning och sedan sterilisera med en varm pärla autoklav. Det är inte tillräckligt att dra i 70% etanol. Ge 0,5 ml S / C steril normal saltlösning preoperativt och omedelbart postoperativt för att kompensera för förlusten av kroppsvätska under operation. Väg mössen. Söva musen med IP Xylazin / ketamin blandning. Det brukar ta 3-5 min för mössen att nå ki…

Representative Results

Måttlig IR-inducerad AKI. Ensidig IR med samtidig kontralateral nefrektomi minskar väsentligt variabilitet i resultaten, men med kortare klämma gånger som behövs för mössen att överleva denna procedur, vi fortfarande funnit att endast 50-60% av mössen utvecklade den förväntade njurinsufficiens 24 tim efter skada (figur 3A). I praktiken har detta skapar svårigheter att utvärdera data om de studier innefattar behandlingsregimer som kan initieras minst 24 timmar efter skadan, …

Discussion

Vi beskriver två modeller av IR-AKI för att studera effekterna av måttlig och svår njurskada. Dessa modeller ger oss möjlighet att framkalla konsekvent och förutsägbar skada med låg dödlighet. Vår protokoll beskriver många av de svårigheter och fallgropar som traditionellt förknippas med denna modell. Dessutom har vi visat att beroende på längden av renal BLOMSTJÄLK fastspänning, inducerar modellen en stor del reversibel mild och måttlig AKI, eller strängare AKI med ofullständig återhämtning och ih…

Materials

Drug or solution	Company	Catalogue number	Comments
Ketamine (anesthetic)	Webster Veterinary	07-881-9413 (100 mg/ml)	Final concentration 30 mg/ml Ketamine with 3 mg/ml Xylazine administered at 3-4 ml/kg (100 mg/kg Ketamine and 10 mg/kg Xylazine)
Xylazine (analgesic)	Webster Veterinary	07-808-1939 (100 mg/ml)	As above
Antisedan (anti-Xylazine)	Webster Veterinary	07-867-7097 (5 mg/ml)	Optional: to reverse effects of Xylazine in order to increase the rate of recovery after surgery Use 0.5-0.7 mg/kg
Buprenorphine (analgesic)	Bedford Laboratories	NDC 55390-100-10 (0.3 mg/ml)	Dose 0.05-0.1 μg/g every 8-12 hr. Make up a 1:5 dilution in sterile normal saline preoperatively and give 2.5-5 μl/g of the diluted solution.
Ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17033-211-38
Betadine swab sticks	Purdue Products L.P.	NDC 67618-153-01
Nolvasan Surgical Scrub	Pfizer Animal Care	300253
			Table 2. Drugs and solutions for I/R surgery.
Iris Scissors	Integra Miltex	VWR 21909-404	For skin and muscle dissection
Curved iris forceps	FST	11065-07	To hold skin and muscle, to remove peri-nephric fat
Blunt forceps	ROBOZ	RS-5228	To manipulate kidneys
Vascular clamp (795 g pressure)	ROBOZ	RS-5459	Good for C57BL/6 and BALB/c mice strains
Schwartz clip applying forceps	ROBOZ	RS-5450	For RS-5459 clamps
Vascular clamp (75-85 g pressure)	FST	18055-02	Optimal for CD1 mice strain, but also can be used for C57BL/6 and BALB/c
Micro-Serrefine Clamp Applicator-14 cm with Lock	FST	18056-14	For FST 18055-02 clamps
Gayman T/Pump (water-bath heated platform)	Braintree Scientific	TP-650	The water heater is set at 38 °C 1 hr prior surgery
15″ W x 24″ Heated platform	Braintree Scientific	HHP-2	Connect to Gayman heated water pump
Heating pad	Braintree Scientific	Model 39DP	Uses microwave for heating. This is useful for warming during recovery
Absorbable suture (Vicryl 5-0)	ETHICON	VCP834G	For fascia and muscle
Non-absorbable suture: monofilament nylon MONOMID 6/0 660B)	CP Medical	CP-B660B-03	For skin
Halsey needle holder: Tungsten Carbide/13 cm	FST	12501-13	To hold suture needles
Timer	FST	06-662-3	To quantify ischemia time
Hot bead sterilizer	FST	18000-45	To sterilize instruments between mice if you are performing multiple surgeries (it is not sufficient to soak instruments in ethanol)
Electric razor	Braintree Scientific	CLP-22965
Tape	Durapore	1538-0
1 ml Syringe	EXELint	26044
Sterile cotton tipped applicators	Kendall	8884541300
Absorbent BenchPad	VWR	56617-014
Surgical drapes	VWR	21902-985	Need to be autoclaved
2” x 2” Gauze Pads	Medi-First	60673
Sterile gloves	Cardinal Health	2D7251
			Table 3. Equipment and instruments for I/R surgery.