فحص<em> ذبابة الفاكهة</em> اليرقات الخلايا الطرفية الرغامي بواسطة المجهر الضوئي
Summary
هنا، نقدم طريقة لتحليل المجهر الضوئي للخلايا القصبة الهوائية في محطة<em> ذبابة الفاكهة</em> اليرقات. هذا الأسلوب يسمح للفحص السريع للفرع والتشكل التجويف في الحيوانات كلها وسيكون من المفيد تحليل المسوخ الفردية أو شاشات لالطفرات التي تؤثر على تطور الخلايا الطرفية.
Abstract
شكل الخلية أمر بالغ الأهمية لوظيفة الخلية. ومع ذلك، على الرغم من أهمية مورفولوجيا الخلايا، لا يعرف إلا القليل حول كيفية الخلايا الفردية توليد الأشكال محددة. ذبابة الفاكهة الخلايا محطة القصبة الهوائية أصبحت نموذجا الوراثية قوية لتحديد وتوضيح دور كل من الجينات المطلوبة لتوليد الأشكال التضاريسية الخلوية. الخلايا محطة هي مكون من مكونات شبكة أنبوبية متفرعة، ونظام القصبة الهوائية الذي يعمل على توريد الأكسجين إلى الأنسجة الداخلية. الخلايا محطة هي نموذج ممتاز للتحقيق في الأسئلة من شكل الخلية كما أنها تمتلك اثنين من أبنية الخلوية متميزة. أولا، خلايا محطة لها مورفولوجيا متفرعة تفصيلا، على غرار الخلايا العصبية المعقدة، وثانيا، يتم تشكيل فروع الخلية محطة وأنابيب رقيقة وتحتوي على تجويف داخل الخلايا غشاء محدد. التحليل الكمي من محطة الخلية رقم الفرع، تنظيم فرع وشكل فرع الفردية، ويمكن استخدامها لتقديم معلومات حول دور الميكانيكية وراثية محددةanisms في صنع خلية متفرعة. تحليل تشكيل أنبوب في هذه الخلايا يمكن أن تكشف عن آليات الحفظ من tubulogenesis مشتركة لشبكات أنبوبي الأخرى، مثل الأوعية الدموية الفقارية. نحن هنا وصف التقنيات التي يمكن استخدامها لإصلاح بسرعة، صورة، وتحليل كل أنماط المتفرعة وتشكيل أنبوب في الخلايا الطرفية داخل يرقات ذبابة الفاكهة. هذه التقنيات يمكن استخدامها لتحليل الخلايا الطرفية في البرية من نوع ومتحولة الحيوانات، أو الفسيفساء الوراثية. بسبب الكفاءة العالية من هذا البروتوكول، وأيضا مناسبة تماما لأنها وراثية، المستندة إلى رني، أو شاشات المخدرات في النظام القصبة الهوائية ذبابة الفاكهة.
Introduction
شكل الخلية هو أمر حاسم لوظيفة الخلايا الفردية داخل الكائن الحي، وكذلك الخلايا التي وظيفة كجزء من النسيج أو العضو. نحن نستخدم خلايا ذبابة الفاكهة محطة القصبة الهوائية، وهو مكون من الجهاز التنفسي الحشرات، للتحقيق في الآليات الجزيئية التي تشارك في السيطرة على نوعين الحفظ من التشكل الخلوي: المتفرعة وتشكيل أنبوب (lumenogenesis). وتقع محطة الخلايا على نصائح من شبكة من أنابيب متفرعة الذي يعمل على إيصال الأوكسجين إلى الأنسجة الداخلية (1) ولها مورفولوجيا متفرعة معقدة والتي تعتمد على مسار الإشارات جمعية جيل المستقبل التي تسيطر عليها مستويات الاوكسجين المحلية داخل الأنسجة المستهدفة 2. فروع الخلية محطة هي أنابيب رقيقة، مع التجويف التحت خلوية مليئة بالغاز من خلال تشغيل كل فرع. أبنية الخلوية متميزة من الخلايا الطرفية، جنبا إلى جنب مع سهولة عن طريق التحليل الجيني التي يمكن أن يؤديها في ذبابة الفاكهة، وجعل هذه الخلايا نموذج F ممتازأو التحقيق في آليات ثمرة الخلوية، المتفرعة، وتشكيل أنبوب داخل الخلايا. وقد أثبتت الخلايا محطة نموذجا مفيدا لفهم بعض مسارات الإشارات المؤدية إلى تمايز الخلية متفرعة، ثمرة، ونضوج 2-4. باستخدام هذا النظام غير متحيز، وقد أجريت شاشات الوراثية إلى الأمام بالنسبة المسوخ التشكل الخلية، مما أسفر عن نظرة ثاقبة آليات السيطرة على شكل الخلية 5،6. على سبيل المثال، فقد كشفت هذه الشاشات أن RabGAP محددة مطلوب لقطبية هيكل الخلية والاتجار حويصلة في تشكيل التجويف وتحديد المواقع (7)؛ أن التصاق إنتغرين بوساطة مطلوب من أجل الاستقرار فرع 8، وأن البروتينات PAR-قطبية الظهارية تنظيم الاتجار غشاء الاستقطاب المطلوبة لكلا المتفرعة وتشكيل التجويف 9. وقد أظهرت دراسات أخرى في الخلايا الطرفية التي تراكم أكتين غير المتماثلة وتنظيم أنيبيب مطلوب للاستطالة الخلية وlumenogenesis <sتصل> 10. وهكذا، وآليات متنوعة، الخلية المحمية البيولوجية تسهم في محطة التشكل الخلية.
هنا، نحن تصف طريقة لإصلاح بسرعة سليمة، الطور الثالث يرقات ذبابة الفاكهة لتحليل محطة خلية المتفرعة وتشكيل التجويف. ويمكن أيضا أن يتم هذا البروتوكول خارجا على الحيوانات على حد سواء الطور الأول والثاني. المفتاح لهذه التقنية هو القدرة على تصور الخلايا الطرفية التي وصفت وراثيا بواسطة فلوري بروتين تعبير مباشرة من خلال إهاب اليرقات من الحيوانات سليمة. لأن هذا الإجراء لا يتطلب أي تلاعب في مرحلة ما بعد التثبيت، مثل تلوين الأجسام المضادة، لمراقبة الخلايا، فإنه هي مناسبة تماما لتحليل إنتاجية عالية، بما في ذلك الفحص الجيني أو المخدرات. فلوري بروتين تعبير يكشف عن هيكل من الفروع cytoplasmically مليئة. يمكن رصدها تشكيل أنبوب بالتوازي باستخدام المجهر brightfield لتحديد التجويف مليئة بالغاز، الذي يتناقض مع السوائل المحيطة ملءالأنسجة إد.
المدرجة في هذا البروتوكول هو طريقة لتوليد الفسيفساء الجينية على أساس نظام MARCM 11، لإنتاج خلايا متماثلة اللواقح محطة متحولة المسمى مع البروتينات الفلورية في الحيوانات غير المسماة خلاف ذلك. وهذا أمر ضروري، لأن الخلايا الطرفية وضع فقط هياكلها المعقدة في وقت متأخر نسبيا في التنمية؛ الفسيفساء الوراثية تسمح لتجاوز متطلبات الجينات في الأنسجة الأخرى في مجال التنمية في وقت سابق. . لتوليد الحيوانات المستنسخة MARCM، وصفت القصبة الهوائية باستخدام برنامج تشغيل القصبة الهوائية محددة لاهث (زجاجة) 12 صفها هنا هو بروتوكول لذبابة الفاكهة كروموسوم X؛ للصبغيات أخرى، إجراء مماثل يمكن استخدامها، مع الكواشف الجينية المناسبة للكروموسوم يجري فحصها. هنا، وصفت القصبة الهوائية عن طريق التعبير عن GFP المترجمة cytoplasmically، ولكن هذا الإجراء يعمل بشكل جيد على قدم المساواة مع التعبير عن البروتينات الفلورية الأخرى، مثل DsRed.
بالإضافة إلى ذلك، أدرجنا طريقة لقياس أنماط المتفرعة وتشكيل التجويف في الخلايا الطرفية، على أساس الطرق وضعت لوصف أنماط فرع العصبية 13. هذا النوع من البيانات الكمية يمكن أن تكون حاسمة في المميزين الدور الدقيق للجينات في عملية التفرع أو lumenogenesis، فضلا عن السماح لإجراء مقارنات مباشرة بين المسوخ مختلف 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقنية تثبيت حرارة الموصوفة هنا هي أداة سريعة ومريحة للتصوير ذبابة الفاكهة اليرقات الخلايا محطة القصبة الهوائية. هنا، ونحن نستخدم هذه التقنية لدراسة المتفرعة ونمط التجويف من الخلايا من النوع البري. خلايا القصبة الهوائية معربا عن GFP، مدفوعا المروج محددة القصبة ا…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر جيليان ستانفيلد للتعليق على المخطوطة. ويدعم TAJ من جامعة يوتا علم الوراثة تدريب جرانت T32-GM007464 من NIGMS المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Student Dumont #5 forceps | Fine Scientific Tools | 91150-20 | |
| Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent) | Leica | MZ16 | |
| AxioImager M1 compound microscope (or equivalent) | Carl Zeiss | Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE | |
| 100% Glycerol | BioExpress | M152-4L | |
| Fly stock | Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A | ||
| Fly stock | Genotype: y w FRT19A |
Referências
- Manning, G., Krasnow, M. A. Development of the Drosophila Tracheal System. The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).
- Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF. Cell. 99 (2), 211-220 (1999).
- Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis. Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).
- Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation. PLoS ONE. 7 (9), e45649 (2012).
- Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system. PLoS Genetics. 7 (7), e1002087 (2011).
- Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila. Genética. 176 (4), 2279-2291 (2007).
- Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth. Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).
- Levi, B. P., Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. Drosophila talin and integrin genes are required for maintenance of tracheal terminal branches and luminal organization. Development. 133 (12), 2383-2393 (2006).
- Jones, T. A., Metzstein, M. M. A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster. Genética. 189 (1), 153-164 (2011).
- Gervais, L., Casanova, J. In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell. Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. A nuclear GFP/ß-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila. Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).
- Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -. C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
- Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting. Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).
