כאן, אנו מציגים שיטה לניתוח מיקרוסקופ אור של תאים סופניים בקנה נשימה<em> דרוזופילה</em> זחלים. שיטה זו מאפשרת בדיקה מהירה של ענף ומורפולוגיה לום בבעלי חיים שלמים ויהיה שימושי עבור ניתוח של מוטציות או מסכים למוטציות המשפיעות על התפתחות תאי מסוף בודדות.
צורת תא היא קריטית לתפקוד תא. עם זאת, למרות חשיבותה של מורפולוגיה של תאים, מעט מאוד ידוע על אופן בו תאים בודדים ליצור צורות ספציפיות. תאים סופניים קנו נשימה תסיסנית הפכו מודל גנטי רב עוצמה כדי לזהות ולהבהיר את התפקידים של גנים הנדרשים ליצירת מורפולוגיות הסלולר. תאי הדקים הם מרכיב של רשת צינורות מסועפת, המערכת לקנה הנשימה המתפקדת כדי לספק חמצן לרקמות פנימיות. תאי Terminal הם מודל מצוין לחקר שאלות של צורת תא כפי שהם בעלי שתי ארכיטקטורות סלולריות שונות. ראשית, יש תאים סופניים מורפולוגיה קנים משוכללת, בדומה לתאי עצב מורכבים; שני, סניפי מסוף סלולרי נוצרים כדקים צינורות ומכילים תאי לום קרום הנכנס. ניתוח כמותי של מספר מסוף תא סניף, ארגון סניף וסניף צורה פרטנית, ניתן להשתמש בו כדי לספק מידע על תפקידו של mech הגנטי הספציפיanisms בהתהוות של תאים מסועפים. ניתוח של היווצרות צינור בתאים אלה יכולים לחשוף את המנגנונים נשמרים של tubulogenesis משותפים לרשתות צינורי אחרות, כגון כלי דם החוליות. כאן אנו מתארים טכניקות שיכולים לשמש כדי לתקן במהירות, תמונה, ולנתח את שני דפוסי הסתעפות והיווצרות תאי צינור במסוף בתוך זחלי דרוזופילה. טכניקות אלה יכולים לשמש כדי לנתח תאים סופניים בחיות הבר מסוג ומוטציה גנטיים, או פסיפסים. בגלל היעילות הגבוהה של פרוטוקול זה, הוא גם מתאים מאוד לגנטי, RNAi מבוסס, או מסכי סמים במערכת תסיסנית קנה הנשימה.
צורת תא היא קריטית לתפקוד של תאים בודדים בתוך האורגניזם, כמו גם תאים שמתפקדים כחלק מאיבר או רקמה. אנו משתמשים בתאים תסיסנית קנו נשימת מסוף, מרכיב של מערכת הנשימה החרקים, כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המשתתפים בשליטה על שני סוגים נשמרים של מורפולוגיה תאית: היווצרות צינור (lumenogenesis) והסתעפות. תאי מסוף נמצאים בקצוות של רשת מסועף של צינורות שפונקציות כדי לספק חמצן לרקמות פנימיות 1 ויש לי מורפולוגיה קנים משוכללת אשר תלוי במסלול איתות FGF שהוא נשלט על ידי רמות חמצן מקומיות בתוך יעד רקמות 2. ענפים סלולריים מסופים צינורות דקים, עם לום subcellular מלאי גז המתרוצץ בכל סניף. הארכיטקטורות שונות של תאים הסלולריות מסופים, יחד עם קלות שבה ניתן לבצע ניתוח גנטי בדרוזופילה, להפוך את התאים האלה F מודל מצויןאו חקר מנגנונים של תולדה סלולרית, מסתעף, והיווצרות צינור תוך תאית. תאי מסוף הוכיחו מודל שימושי להבנת חלק ממסלולי האיתות המובילה להתמיינות תאים מסועפת, תולדה, והתבגרות 2-4. באמצעות מערכת זו משוחדת, מסכי קדימה גנטיים למוטנטים המורפוגנזה סלולריים כבר בוצעו, מניב תובנות מנגנוני שליטה תא צורה 5,6. לדוגמה, מסכי אלה חשפו כי RabGAP ספציפי נדרש לקוטביות cytoskeletal וסחר בשלפוחית בהיווצרות ומיצוב 7 לום; שהידבקות integrin בתיווך נדרשת ליציבות ענף 8, וכי חלבוני PAR-קוטביות אפיתל לווסת את סחר קרום מקוטב נדרש עבור שניהם לום היווצרות 9 הסתעפות ו. מחקרים אחרים בתאי מסוף הראו כי הצטברות אקטין סימטרית וארגון microtubule נדרש להתארכות תא וlumenogenesis <sעד> 10. לפיכך, מנגנוני תאים שונים, נשמרים ביולוגיים יתרמו להמורפוגנזה תא מסוף.
כאן, אנו מתארים שיטה לתקן את הזחלים תסיסנית שלישי instar-שלמים לניתוח של מסוף היווצרות לום תא הסתעפות ובמהירות. פרוטוקול זה גם יכול להתבצע על בעלי החיים instar גם ראשונים והשני. מפתח לטכניקה זו היא היכולת לדמיין תאי מסוף שכותרתו גנטית על ידי ביטוי חלבון פלואורסצנטי ישירות דרך ציפורן הזחל של בעלי חיים שלמים. מאז הליך זה אינו דורש שום מניפולציות לאחר קיבוע, כגון צביעת נוגדנים, כדי לבחון את התאים, הוא גם מתאים לניתוח תפוקה גבוהה, כולל בדיקות גנטיות או בסמים. ביטוי חלבון פלואורסצנטי חושף את המבנה של הסניפים המלאים cytoplasmically. היווצרות צינור יכולה להיות במעקב במקביל באמצעות מיקרוסקופ brightfield לזהות לום גז מלא, העומד בניגוד לסביבת נוזל המילוירקמות ed.
בפרוטוקול זה כלל הוא השיטה ליצירת פסיפסים גנטיים המבוססים על מערכת MARCM 11, כדי לייצר תאים סופניים מוטציה הומוזיגוטים שכותרתו עם חלבוני ניאון בבעלי חיים בדרך אחרת ללא תווית. זה הכרחי, שכן תאים סופניים לפרט המבנים המורכבים שלהם רק בשלב מאוחר יחסית בפיתוח; פסיפסים גנטיים מאפשרים מעקף של דרישות הגנים ברקמות אחרות מוקדמת יותר בפיתוח. . כדי ליצור שיבוטים MARCM, קנה נשימה מסומנות באמצעות מנהל ההתקן הספציפי לקנה נשימת הנשימה (BTL) 12 מתוארת כאן הוא הפרוטוקול לכרומוזום X תסיסנית; לכרומוזומים אחרים, ניתן להשתמש בהליך דומה, עם חומרים כימיים גנטיים מתאים לכרומוזום להיות בדק. כאן, קנה נשימה מתויגת על ידי ביטוי של GFP cytoplasmically מקומי, אבל ההליך עובד באותה מידה גם עם ביטוי של חלבוני ניאון אחרים, כגון DsRed.
בנוסף, יש לנו כלל שיטה לכמת דפוסי הסתעפות והיווצרות לומן בתאים סופניים, המבוסס על שיטות שפותחו לאפיון דפוסים עצביים 13 סניפים. סוג זה של נתונים כמותיים יכול להיות קריטי בתפקיד ההבחנה המדויק של הגנים בתהליך ההסתעפות או lumenogenesis, כמו גם לאפשר להשוואה ישירה בין מוטציות שונות 9.
טכניקת קיבוע החום המתוארת כאן היא כלי מהיר ונוח לתאים סופניים קונים נשימת הדמיה תסיסנית זחל. כאן, אנו משתמשים בטכניקה זו כדי לבחון את ההסתעפות ודפוס לומן של wild-type תאים. קנו נשימת תאים להביע GFP, מונע על ידי האמרגן הספציפי לקנה הנשימה הנשימה, יכולים להיות בקלות …
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לג'יליאן סטנפילד להערות על כתב היד. טאג' נתמך על ידי אוניברסיטת יוטה הגנטיקה הדרכה גרנט T32-GM007464 מNIGMS NIH.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Student Dumont #5 forceps | Fine Scientific Tools | 91150-20 | |
Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent) | Leica | MZ16 | |
AxioImager M1 compound microscope (or equivalent) | Carl Zeiss | Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE | |
100% Glycerol | BioExpress | M152-4L | |
Fly stock | Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A | ||
Fly stock | Genotype: y w FRT19A |