의 검사<em> 초파리</em가벼운 현미경으로> 애벌레 기관 내 터미널 셀
Summary
여기, 우리는 기관 단자 세포의 광학 현미경 분석에 대한 방법을 제시<em> 초파리</em> 애벌레. 이 방법은 전체 동물의 지사와 루멘 형태의 빠른 검사를 위해 허용하고 개별 돌연변이 또는 터미널 세포 발달에 영향을 미치는 돌연변이 화면의 분석에 유용 할 것입니다.
Abstract
세포의 모양은 세포 기능에 중요합니다. 그러나 세포 형태의 중요성에도 불구하고, 약간은 개별 세포가 특정 모양을 생성하는 방법에 대해 잘 알려져 있습니다. 초파리 기관 단자 세포는 세포의 형태학 생성에 필요한 유전자의 역할을 확인하고 해명 할 수있는 강력한 유전 적 모델이되고있다. 터미널 세포 분지 관 네트워크의 구성 요소, 내부 조직에 산소를 공급하는 기능하는 기관 시스템입니다. 터미널 세포들은이 두 가지 세포 구조를 가지고 같은 세포 형태의 질문 조사를위한 훌륭한 모델입니다. 첫째, 단말기 세포는 복잡한 신경 세포와 유사한 정교한 지형 형태를 가지고, 둘째, 단말기 세포의 가지 얇은 튜브로 형성 막 결합 세포 내강을 포함하고 있습니다. 터미널 셀 지점 번호, 지점 조직과 개인의 지사 형태의 정량 분석은 특정 유전자 기계화의 역할에 대한 정보를 제공하는 데 사용할 수 있습니다분기 셀의 제작에 anisms. 이러한 세포의 관 형성 분석은 척추 동물의 혈관과 같은 다른 관 네트워크에 공통 tubulogenesis의 보존 메커니즘을 밝힐 수 있습니다. 여기에서 우리는 빠르게 이미지를 수정하는 데 사용할 수있는 기술을 설명하고, 초파리 유충에서 모두 분기 패턴과 단말기 세포의 관 형성을 분석합니다. 이 기술은 야생형과 돌연변이 동물, 또는 유전 모자이크의 터미널 세포를 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 이 때문에 프로토콜의 높은 효율, 그것은 또한뿐만 유전, RNAi의 기반 또는 초파리 기관 시스템의 마약 화면에 적합합니다.
Introduction
세포의 모양은 유기체 내의 개별 세포의 기능에 중요한뿐만 아니라, 세포 인 조직이나 기관의 일부로서 그 기능. 분기 및 튜브 형성 (lumenogenesis) : 우리는 세포 형태의 두 가지 보존 유형을 제어에 참여하는 분자 메커니즘을 조사하기 위해 초파리 기관 단자 세포, 곤충 호흡기 시스템의 구성 요소를 사용합니다. 터미널 세포는 분기 튜브 네트워크의 끝 위치되는 내부 조직 1에 산소를 전달하고 표적 조직 2에서 현지 산소 농도에 의해 제어되는 FGF 신호 전달 경로에 따라 정교한 지형 형태를 가지고하는 기능.에게 터미널 셀 분기 각 지점을 통해 실행 가스로 채워진 세포 내 루멘으로, 얇은 튜브입니다. 유전자 분석은 초파리에서 수행 할 수있는 용이성과 함께 단말기 세포의 독특한 세포 구조는,이 세포에게 훌륭한 모델 F을또는, 휴대 가지의 메커니즘을 조사 분기 및 세포 내 튜브를 형성합니다. 터미널 세포는 분기 세포 분화, 가지,과 성숙 2-4로 이어지는 신호 전달 경로의 일부를 이해하기위한 유용한 모델을 입증했다. 이 시스템은 공정한 사용하여, 세포 형태 형성의 돌연변이에 대한 앞으로 유전자 스크린은 세포의 모양 5,6를 제어 메커니즘에 대한 통찰력을 항복 수행되었다. 인테 매개 접착력을 가지 안정성 8을 위해 필요합니다; 예를 들어,이 화면은 특정 RabGAP가 루멘 형성과 포지셔닝 7 골격 극성 소포 인신 매매를 위해 필요하다는 것을 밝혀 그 상피 PAR 극성 단백질은 필요한 편광 막 인신 매매를 규제 분기 및 루멘 형성 9 모두. 단말기 세포에서 다른 연구는 비대칭 말라 축적과 미세 소관 조직 세포의 신장과 lumenogenesis 필요한 것으로 나타났습니다 <s> 10 최대. 따라서, 다양한, 보존 세포 생물 학적 메커니즘 터미널 세포 형태 형성에 기여한다.
여기, 우리는 신속하게 터미널 휴대 분기 및 루멘 형성의 분석을위한 본래 제 령 초파리의 애벌레를 해결하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 첫 번째와 두 번째 모두 탈피 동물에서 수행 할 수 있습니다. 이 기술의 핵심 유전자 직접 그대로 동물의 애벌레 표피를 통해 형광 단백질 식으로 표시되어 단자 세포를 시각화 할 수있는 기능입니다. 이 절차와 같은 항체 염색으로 사후 고정 조작은, 세포를 관찰 할 필요가 없기 때문에, 그것은 잘 유전자 또는 약물 검사를 포함하여, 높은 처리량 분석에 적합합니다. 형광 단백질의 발현은 cytoplasmically 채워진 가지의 구조를 보여준다. 관 형성은 병렬 주변의 유체은 – 채우기와 대조 가스 채워진 루멘을 식별하는 브라이트 현미경을 사용하여 모니터링 할 수 있습니다ED 조직.
이 프로토콜에 포함 달리 레이블이 동물에 형광 단백질로 표시된 동형 접합체 돌연변이 단자 세포를 생산하는 MARCM 시스템 11에 따라 유전 모자이크를 생성하는 방법입니다. 단말기 세포는 비교적 늦게 개발에서의 복잡한 구조를 정교 때문에 이것은 필요하다, 유전 모자이크 이전에 개발에 다른 조직의 유전자 요구 사항을 우회 할 수 있습니다. . MARCM 클론을 생성하는 기관이 여기에 설명 숨 기관 – 특정 드라이버 (BTL) 12를 사용하여 표시하는 것은 초파리의 X 염색체를위한 프로토콜이며, 다른 염색체에 대해 유사한 절차가되는 염색체에 적합한 유전자 시약과 함께 사용할 수 있습니다 하였다. 여기에, 기관은 cytoplasmically 지역화 된 GFP의 발현에 의해 표시되지만, 절차는는 DsRed 다른 형광 단백질의 발현과 동일하게 작동합니다.
또한, 우리는 신경 가지 패턴 13 특성화 개발 방법에 따라 단말기 세포에서 분기 패턴과 루멘 형성을 정량화하는 방법을 포함했다. 정량적 데이터의이 종류는 안목 정확한 분기 또는 lumenogenesis 과정에서 유전자의 역할뿐만 아니라, 다른 돌연변이 9 사이의 직접 비교를 허용에 중요 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 열 고정 기술은 이미징 Drosophila의 애벌레 기관 단자 세포에 대한 신속하고 편리한 도구입니다. 여기, 우리는 분기와 야생형 세포의 내강 패턴을 조사하기 위해이 기술을 사용합니다. 숨 기관 특이 적 프로모터에 의해 구동 GFP를, 표현 기관 세포는 열 고정 후 유충의 표피를 통해 쉽게 시각화 할 수 있습니다. 뿐만 아니라 공기 채워진 루멘의 그 같은 개별 단말기 세포?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 원고에 대하여 코멘트를위한 질리안 스탠 필드 감사합니다. TAJ는 NIH의 NIGMS에서 유타 유전학 교육 그랜트 T32-GM007464의 대학에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Student Dumont #5 forceps | Fine Scientific Tools | 91150-20 | |
| Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent) | Leica | MZ16 | |
| AxioImager M1 compound microscope (or equivalent) | Carl Zeiss | Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE | |
| 100% Glycerol | BioExpress | M152-4L | |
| Fly stock | Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A | ||
| Fly stock | Genotype: y w FRT19A |
Referências
- Manning, G., Krasnow, M. A. Development of the Drosophila Tracheal System. The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).
- Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF. Cell. 99 (2), 211-220 (1999).
- Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis. Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).
- Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation. PLoS ONE. 7 (9), e45649 (2012).
- Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system. PLoS Genetics. 7 (7), e1002087 (2011).
- Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila. Genética. 176 (4), 2279-2291 (2007).
- Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth. Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).
- Levi, B. P., Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. Drosophila talin and integrin genes are required for maintenance of tracheal terminal branches and luminal organization. Development. 133 (12), 2383-2393 (2006).
- Jones, T. A., Metzstein, M. M. A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster. Genética. 189 (1), 153-164 (2011).
- Gervais, L., Casanova, J. In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell. Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. A nuclear GFP/ß-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila. Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).
- Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -. C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
- Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting. Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).
