Экспертиза<em> Drosophila</em> Личинок трахеи Клетки терминала с помощью световой микроскопии
Summary
Здесь мы представляем метод для легкого анализа микроскопии клетки трахеи терминала в<em> Drosophila</em> Личинок. Этот метод позволяет быстро экспертизы отраслевых и просвета в целом морфология животных и было бы полезно для анализа отдельных мутантов или экраны для мутаций, влияющих на развитие терминала клетки.
Abstract
Сотовые формы имеет решающее значение для функции клеток. Однако, несмотря на важность морфологии клеток, очень мало известно о том, как отдельные клетки производят конкретные формы. Трахеи клетки Drosophila терминала стали мощным генетическая модель для определения и выяснения роли генов, необходимых для создания сотовой морфологии. Терминал клетки являются составной частью разветвленных трубчатых сети, трахеи система, которая функционирует для подачи кислорода к внутренней ткани. Терминал клетки являются прекрасной моделью для исследования вопросов формы клеток, поскольку они обладают двух различных сотовых архитектур. Во-первых, терминал клетки имеют сложную разветвленную морфологии, похож на комплекс нейронов, во-вторых, конечные ветви клетки образуются в тонких трубок и содержат мембраны внутриклеточных просвет. Количественный анализ выводом элемента номер ветви, отраслевой организации и индивидуальные формы филиал, могут быть использованы для предоставления информации о роли специфических генетических мехамов в создании разветвленной клетки. Анализ трубка образование в этих клетках может выявить консервативные механизмы тубулогенез общими для других трубчатых сетей, таких как позвоночные сосудистой сети. Здесь мы опишем методы, которые могут быть использованы для быстро исправить, изображений и проанализировать как ветвящиеся структуры и образование трубки в терминале клеток внутри личинки дрозофилы. Эти методы могут быть использованы для анализа терминал клетки дикого типа и мутантных животных, или генетических мозаик. Из-за высокой эффективности этого протокола, он также хорошо подходит для генетических, на основе РНК-интерференции, или наркотики экранов у дрозофилы трахеи системы.
Introduction
Сотовые форма является критической для функции отдельных клеток в организме, а также клетки, которые функционируют как часть ткани или органа. Мы используем Drosophila трахеи клетки терминал, компонент насекомых дыхательной системы, исследовать молекулярные механизмы, которые участвуют в контроле двух консервативных типов клеточной морфологии: ветвления и образование трубки (lumenogenesis). Терминал клетки расположены на концах сети разветвленных труб, который функционирует для доставки кислорода к внутренним тканям 1 и имеют сложную разветвленную морфология которых зависит от пути FGF сигнализации, которая управляется на местном уровне кислорода в тканях-мишенях 2. Конечные ветви ячейки тонких трубок, с газонаполненными субклеточную просвет проходит через каждого филиала. Различных сотовых архитектур терминал клетки, наряду с легкость, с которой генетический анализ может быть выполнен в Drosophila, делает эти клетки отличный е моделиили следственного механизмов клеточных вырост, ветвление и внутриклеточное образование трубки. Терминал клетки доказали полезной моделью для понимания некоторых сигнальных путей, ведущих к разветвленной дифференцировки клеток, заросли, и созревание 2-4. Используя эту систему объективной, вперед генетический скрининг мутантов клетки морфогенеза были выполнены, что дает информацию о механизмах регуляции клеточного формы 5,6. Например, эти экраны показали, что конкретный RabGAP требуется для цитоскелета полярности и везикул в просвете формирования и позиционирование 7; что интегрин-опосредованную адгезию требуется для ветви стабильность 8, и что эпителиальные PAR-полярность белки регулируют поляризованный торговли мембраны требуется для ветвления и формирования просвета 9. Другие исследования в терминале клетках показали, что асимметричный накоплению актина и организации микротрубочек необходима для удлинения клеток и lumenogenesis <sдо> 10. Таким образом, разнообразные, консервативные клетка биологические механизмы способствуют терминала морфогенеза клетки.
Здесь мы описываем способ быстро исправить нетронутыми третьего возраста личинок Drosophila для анализа клеммой элемента ветвления и образование просвета. Этот протокол также может быть выполнена на обоих первом и втором животных возрастной стадии. Ключ для этого метода является возможность визуализации терминал клетки, генетически меченных флуоресцентными экспрессии белка непосредственно через личиночной кутикулы интактных животных. Так как эта процедура не требует никакой последующей фиксацией манипуляций, таких как окрашивание антител, наблюдать клетки, он хорошо подходит для высокопроизводительного анализа, в том числе генетические или скрининга лекарственных средств. Флуоресцентные экспрессии белка раскрывает структуру цитоплазматически заполненные ветвей. Образование трубки можно отслеживать в режиме параллельного использования светлого микроскопии для идентификации газонаполненных просвета, который контрастирует с окружающей жидкостью заполненияЭд тканей.
В этом протоколе является способ генерации генетической мозаики на основе системы MARCM 11, для производства гомозиготных мутантных клеток терминал меченных флуоресцентными белков в противном случае немеченого животных. Это необходимо, так как терминал клетки только разработать свои сложные структуры относительно поздно в процессе развития; генетической мозаики позволяют обход требований гена в других тканях ранее в развитии. . Для генерации MARCM клонов, трахеи помечены использованием трахеи конкретного драйвера дыхание (бут) 12 Описанный здесь протокол для хромосомы Drosophila X, для других хромосом, аналогичная процедура может быть использована, с генетическими реагентов соответствующей хромосоме быть рассмотрены. Здесь, трахеи помечены путем экспрессии цитоплазматически локализованных GFP, но процедура работает одинаково хорошо с экспрессией другие флуоресцентные белки, такие как DsRed.
Кроме того, мы включили метод для количественного ветвящиеся структуры и формирования в просвете терминала элементы на основе методов, разработанных для характеристики моделей нейронных филиал 13. Этот вид количественных данных может иметь решающее значение в плане определения точной роли генов в процессе разветвления или lumenogenesis, а также позволяет прямое сравнение различных мутантов 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методика фиксации тепла описанный здесь быстрый и удобный инструмент для работы с изображениями дрозофилы личиночной трахеи клетки терминала. Здесь мы используем эту технику, чтобы изучить ветвления и просвет структуру клеток дикого типа. Трахеи клеток, экспрессирующих GFP, движи…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Джиллиан Stanfield замечания по рукописи. Таджикистан при поддержке Университета штата Юта генетики Обучение Грант T32-GM007464 от NIGMS NIH.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Student Dumont #5 forceps | Fine Scientific Tools | 91150-20 | |
| Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent) | Leica | MZ16 | |
| AxioImager M1 compound microscope (or equivalent) | Carl Zeiss | Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE | |
| 100% Glycerol | BioExpress | M152-4L | |
| Fly stock | Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A | ||
| Fly stock | Genotype: y w FRT19A |
Referências
- Manning, G., Krasnow, M. A. Development of the Drosophila Tracheal System. The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).
- Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF. Cell. 99 (2), 211-220 (1999).
- Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis. Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).
- Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation. PLoS ONE. 7 (9), e45649 (2012).
- Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system. PLoS Genetics. 7 (7), e1002087 (2011).
- Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila. Genética. 176 (4), 2279-2291 (2007).
- Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth. Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).
- Levi, B. P., Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. Drosophila talin and integrin genes are required for maintenance of tracheal terminal branches and luminal organization. Development. 133 (12), 2383-2393 (2006).
- Jones, T. A., Metzstein, M. M. A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster. Genética. 189 (1), 153-164 (2011).
- Gervais, L., Casanova, J. In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell. Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. A nuclear GFP/ß-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila. Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).
- Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -. C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
- Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting. Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).
