El examen de<em> Drosophila</em> Larvas células traqueales de terminales por microscopía de luz
Summary
A continuación, presentamos un método para el análisis de microscopía de luz de las células traqueales de terminales<em> Drosophila</em> Larvas. Este método permite el examen rápido de la rama y la morfología del lumen en los animales enteros y sería útil para el análisis de mutantes o pantallas para las mutaciones que afectan el desarrollo de células de terminales individuales.
Abstract
La forma celular es crítica para la función celular. Sin embargo, a pesar de la importancia de la morfología de las células, se sabe poco sobre cómo las células individuales generan formas específicas. Células terminales traqueal de Drosophila se han convertido en un modelo genético de gran alcance para identificar y aclarar el papel de los genes necesarios para la generación de morfologías celulares. Células de terminales son un componente de una red tubular ramificada, el sistema traqueal que funciona para suministrar oxígeno a los tejidos internos. Células de terminales son un excelente modelo para la investigación de las cuestiones de forma de la célula, ya que poseen dos arquitecturas celulares distintos. En primer lugar, las células terminales tienen una morfología ramificada elaborada, similar a las neuronas complejas; segundo, ramas de células terminales se forman como tubos delgados y contienen un lumen intracelular unida a la membrana. El análisis cuantitativo del número de rama terminal de las células, la organización y la forma de rama rama individual, se puede utilizar para proporcionar información sobre el papel de los mecanismos genética específicamos en la fabricación de una célula ramificada. Análisis de la formación del tubo en estas células puede revelar los mecanismos conservadas de tubulogénesis comunes a otras redes tubulares, tales como la vasculatura del vertebrado. Aquí se describen las técnicas que se pueden utilizar para fijar rápidamente, imagen, y analizamos los dos patrones de ramificación y la formación del tubo en las células terminales dentro de las larvas de Drosophila. Estas técnicas se pueden utilizar para analizar las células terminales en los animales de tipo salvaje y mutante, o mosaicos genéticos. Debido a la alta eficiencia de este protocolo, también es muy adecuado para el genético, basado en RNAi, o pruebas de drogas en el sistema traqueal de Drosophila.
Introduction
La forma celular es crítica para la función de las células individuales dentro de un organismo, así como las células que funcionan como parte de un tejido u órgano. Utilizamos Drosophila células terminales traqueales, un componente del sistema respiratorio del insecto, para investigar los mecanismos moleculares que participan en el control de dos tipos conservadas de morfología celular: Bifurcaciones y formación del tubo (lumenogenesis). Células de terminales se encuentran en la punta de una red de tubos ramificados que funciona para suministrar oxígeno a los tejidos internos 1 y tienen una morfología ramificada elaborado que depende de una vía de señalización de FGF que es controlada por los niveles de oxígeno locales dentro de los tejidos de destino 2. Ramas de células de terminales son tubos delgados, con un llenas de gas lumen subcelulares se ejecutan a través de cada rama. Las arquitecturas celulares distintos de las células terminales, junto con la facilidad con la que el análisis genético puede llevarse a cabo en Drosophila, hacen que estas células un modelo excelente fo la investigación de los mecanismos de derivación celular, ramificación y formación del tubo intracelular. Células de terminales han demostrado ser un modelo útil para entender algunas de las vías de señalización que conducen a la diferenciación celular ramificado, carnosidad, y la maduración 2-4. El uso de este sistema imparcial, se han realizado las pantallas adelante genéticos para la morfogénesis de células mutantes, dando ideas sobre los mecanismos que controlan la forma celular 5,6. Por ejemplo, estas pantallas han puesto de manifiesto que es necesario un RabGAP específica para la polaridad del citoesqueleto y el tráfico de vesículas en la formación del lumen y de posicionamiento 7; que se requiere la adhesión mediada por la integrina para la estabilidad rama 8, y que las proteínas PAR-polaridad epiteliales regular el tráfico de membrana polarizada requerido tanto para la ramificación y la formación del lumen 9. Otros estudios realizados en células de terminales han demostrado que se requiere la acumulación de actina asimétrica y organización de los microtúbulos para la elongación celular y lumenogenesis <shasta> 10. Por lo tanto, diversos mecanismos biológicos celulares conservadas, contribuyen a la morfogénesis celular terminal.
A continuación, se describe un método para solucionar rápidamente intacta tercer estadio las larvas de Drosophila para el análisis de células ramificación terminal y la formación del lumen. Este protocolo también puede llevarse a cabo tanto en primero y segundo instar animales. La clave de esta técnica es la posibilidad de visualizar las células terminales que están etiquetados genéticamente mediante la expresión de la proteína fluorescente directamente a través de la cutícula larval de los animales intactos. Dado que este procedimiento no requiere ninguna manipulación posteriores a la fijación, tales como la tinción de anticuerpos, para observar las células, que es muy adecuado para análisis de alto rendimiento, incluyendo la investigación genética o drogas. Expresión de la proteína fluorescente revela la estructura de las ramas citoplásmicamente llenas. La formación de tubos se puede controlar en paralelo usando microscopía de campo claro para identificar el lumen lleno de gas, lo que contrasta con el entorno de fluido llenetejidos ed.
Incluido en este protocolo es el método para la generación de mosaicos genéticos basados en el sistema MARCM 11, para producir células mutantes homocigotos terminales marcadas con proteínas fluorescentes en animales no marcados de otro modo. Esto es necesario, ya que las células terminales sólo elaboran sus estructuras complejas relativamente tarde en el desarrollo; mosaicos genéticos permiten la derivación de los requisitos de genes en anteriores en el desarrollo de otros tejidos. . Para generar clones MARCM, la tráquea se etiquetan con el controlador específico de respiración traqueal (BTL) 12 describe aquí es el protocolo para el cromosoma X de Drosophila; para otros cromosomas, un procedimiento similar se puede utilizar, con reactivos genéticos apropiados para el cromosoma ser examinado. Aquí, la tráquea se etiquetan mediante la expresión de una GFP citoplasmática localizada, pero el procedimiento funciona igualmente bien con la expresión de otras proteínas fluorescentes, tales como DsRed.
Además, hemos incluido un método para cuantificar los patrones de ramificación y la formación del lumen de las células terminales, con base en los métodos desarrollados para caracterizar los patrones de ramificación neuronal 13. Este tipo de datos cuantitativos puede ser crítico para discernir el papel preciso de los genes en el proceso de ramificación o lumenogenesis, así como para permitir comparaciones directas entre los diferentes mutantes 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
La técnica de fijación por calor descrito aquí es una herramienta rápida y conveniente para las larvas células terminales traqueales imágenes Drosophila. Aquí, nosotros usamos esta técnica para examinar la ramificación y el patrón de luz de las células de tipo salvaje. Células traqueales que expresan GFP, dirigido por el promotor específico traqueal sin aliento, se pueden visualizar fácilmente a través de la cutícula larval después de la fijación de calor. Los patrones de ramificació…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a Gillian Stanfield los comentarios sobre el manuscrito. TAJ con el apoyo de la Universidad de Utah Genética Formación subvención T32-GM007464 del NIH NIGMS.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Student Dumont #5 forceps | Fine Scientific Tools | 91150-20 | |
| Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent) | Leica | MZ16 | |
| AxioImager M1 compound microscope (or equivalent) | Carl Zeiss | Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE | |
| 100% Glycerol | BioExpress | M152-4L | |
| Fly stock | Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A | ||
| Fly stock | Genotype: y w FRT19A |
Referências
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