Isolering og dyrkning af Mouse Primære Pancreas acinarceller
Summary
I denne publikation beskriver vi en hurtig og bekvem procedure for isolering og dyrkning primære pancreas acinarceller fra murine bugspytkirtlen. Denne metode udgør en værdifuld tilgang til at studere fysiologi af friske primære normale / utransformeret exokrine bugspytkirtlen celler.
Abstract
Denne protokol tillader hurtig isolation (i mindre end 1 time) af murine pancreas acini, hvilket gør det muligt at fastholde dem i kultur for mere end en uge. Mere end 20 x 10 6 acinuscellerne kan opnås fra en enkelt murin bugspytkirtel. Denne protokol giver mulighed for selvstændigt at bearbejde så mange som 10 bugspytkirtler parallelt. Fordi den bevarer acinært arkitektur, er denne model velegnet til at studere fysiologi eksokrine pancreas in vitro i modsætning til cellelinier etableret fra pankreatiske tumorer, som udviser mange genetiske ændringer resulterer i delvis eller fuldstændig tab af deres acinar differentiering.
Introduction
Et ofte stødt problem for forskningslaboratorier arbejder på exokrint pankreasvæv er vanskeligheden ved at dyrke acinar celler in vitro for en periode tilstrækkelig lang til at tillade en langsigtet eksperiment.
En faktor hæmme udviklingen af sådanne dyrkningssystemer er den iboende følsomhed pankreasvæv til eksperimentel manipulation grund af det høje indhold i glycolytiske, proteolytiske og lipolytiske enzymer, som bogstaveligt talt fordøje Bugspytkirtelvævet når de frigives under isoleringen af pancreasceller.
En anden faktor er den bemærkelsesværdige in vitro plasticitet acinarceller, som har en tendens til at miste deres sekretoriske egenskaber og transdifferentiate til andre modne celler, såsom pankreatiske duktale celler eller hepatocyt-lignende celler 1.. In vitro varierer denne celle plasticitet med de eksperimentelle betingelser (såsom dyrkningsmedium sammensætning) 2. </sup> og indfører en grad af kompleksitet i udformningen af passende dyrkningsbetingelser for eksokrine pancreas celler 1..
Adskillige fremgangsmåder er blevet udviklet til isolering og dyrkning af acinarceller, først fra marsvin bugspytkirtlen 3-5. I første omgang disse protokoller involveret fordøjelse af pancreas væv med collagenase, chymotrypsin og en protease cocktail, med ultimativ isolation ved kraftig mekanisk dissociation. Pancreas celler isoleret på denne måde viste unormale strukturelle og funktionelle egenskaber, herunder især et tab på apikale strukturer og betydelige skader på deres membran receptorer. Isolerede celler forblev levedygtige for kun 1 eller 2 dage.
Udarbejdelse af spredte acini fastholder deres intra-og intercellulære arkitektur, bevare cellemembraner og begrænse skader på overfladen receptorer og dermed forbedre eksokrin sekretion som respons på antidiabetika 6-8. Som en result, denne metode giver den store fordel, at udvide acinar cellelevedygtighed til 7-10 dage in vitro. Desuden er denne metode i øjeblikket foretrukket at acinære celleisolering 9-12 fordi vedligeholdelse af intercellulære kontakter, herunder celle kobling af gap junctions, er en væsentlig faktor for eksokrine pancreas acinar celle fænotype 13..
Som dedifferentiering af acinar celler og deres transdifferentiation til duktale celler er en af de foreslåede mekanismer for tilblivelsen af aggressive exokrine pancreascancer 14, den dispergerede acini modellen er også et passende system til at studere bugspytkirtlen plasticitet og dets efterfølgende molekylære mekanismer. Endvidere i kombination med anvendelse af genetisk modificerede dyr 15,16 og udvikling af genoverførsel teknikker (adenoviral 2 eller lentiviral transduktion, anvendelsen af nanopartikler, osv.), dette in vitro primære acinar celle model kanvære meget nyttige i at bestemme, hvor forskellige genetiske dysfunktioner påvirker reguleringen af acinære celledifferentiering eller dedifferentiering og bør give en bedre forståelse for de molekylære begivenheder, der er ansvarlige for indtræden af pancreatitis, forstadier til kræft, samt ændringer i celle plasticitet.
Isolering af spredte acini er den tilgang, vi bruger i vores laboratorium til kultur bugspytkirtlen acinarceller. Vi her beskrive og diskutere den anvendte metode. Det indebærer enzymatisk dissociation af pancreasvæv (med en bakteriel collagenase) koblet til mekanisk sprængning uden dissociation af acinar celler. Mens de fleste protokollerne omfatter dyrkning af acini, enten i suspension eller på specialbehandlet plastsubstrater, vi dyrker dem i suspension kun kortvarigt (til 24 timer), såning dem bagefter på matrix stilladser hvis langvarig cellekultur er påkrævet.
Denne protokol giver mulighed for hurtig isolation (i mindre end 1 time) af dispergeret pancreas acini, bæredygtig for mere end en uge i kultur. Det tillader isolering af mere end 20 x 10 6 acinarceller per mus bugspytkirtlen. Sin enkelhed gør det muligt at behandle uafhængigt så mange som 10 bugspytkirtler parallelt. Ved at opretholde intra-og intercellulære arkitektur acini og dermed acinært fænotype af isolerede primærelementer, udgør denne model et system for studiet af transdifferentiation mekanismer som alle andre eksokrine pancreas modeller øjeblikket er til rådighed stammer fra pancreas tumorer, der udviser mange genetiske ændringer, der fører til cellulær transformation.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokol, beskriver vi en procedure for at isolere bugspytkirtlen acinarceller. Denne metode gør det muligt at isolere mere end 20 x 10 6 acinarceller pr dyr i mindre end 1 time. Takket være den hurtige og enkle gennemførelse (så mange som 10 pancreases kan være uafhængigt behandles per eksperiment i parallel), denne protokol vises som et godt kompromis mellem de eksisterende isoleringsmetoder 3-5,9-12,17.
Kritiske trin / Trouble-shooting
<p c…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takke personalet i AniCan (CrCL, Lyon) for deres teknisk assistance til pasning af dyr. Dette arbejde blev støttet af Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM Avenir Program), Ligue Nationale Contre le Cancer, af Sammenslutningen pour la Recherche sur le Cancer ved Institut National du Cancer, og ved stipendier fra Ligue Nationale Contre le Cancer (JG), fra Institut National du Cancer (JG), fra Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche i Frankrig (RMP og DFV), og fra foreningen pour la Recherche sur le Cancer ( DFV).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Dutscher | 146560 | |
| 10 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357551 | |
| 100 μm filter | Beckton Dickinson | 352360 | |
| 100 mm Petri dish | Beckton Dickinson | 353003 | |
| 1000 μl filter tips | Starlab | S1122-1830 | |
| 20 μl filter tips | Starlab | S1120-1810 | |
| 200 μl filter tips | Starlab | S1120-8810 | |
| 25 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357535 | |
| 5 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357543 | |
| 50 ml polypropylene tube | Beckton Dickinson | 352070 | |
| 6-well plate | Beckton Dickinson | 353046 | |
| Acetic acid 100% | VWR BDH Prolabo | 20104.298 | |
| Collagenase IA | Sigma-Aldrich | C2676 | |
| Curved forceps, Dumont #7 | World Precision Instruments | 14188 | To sterilize before use |
| Dissecting scissors, straight | World Precision Instruments | 14393 | To sterilize before use |
| Epidermal Growth Factor, human | Promokine | C-60180 | |
| Ethanol absolute (AnalaR Normapur) | VWR BDH Prolabo | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| Forceps, Dumont #5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Hank’s Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14025050 | |
| HEPES 1 M (pH 6.98-7.30) | Lonza | 17-737F | |
| Incubator O2/CO2 | Sanyo | MCO-19M | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Matrigel | Beckton Dickinson | 356234 | |
| Microbiological Safety Cabinet, level II | Faster | SafeFast Elite 212 S | |
| Noyes scissors, sharp/sharp tips, German | World Precision Instruments | 500228-G | To sterilize before use |
| Penicillin-Streptomycin mixture | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffer Saline 10x | Gibco | 14200067 | |
| Pipet-Aid | Drummond Scientific Company | Pipet-Aid XP | |
| Pipetman P1000 | Gilson | F123602 | |
| Pipetman P20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P200 | Gilson | F123601 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Scalpel | Paramount Surgimed Ltd. | Disposable Scalpel Size 23 | |
| T25 flask, 25 cm2 | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| Trypsin inhibitor, from Glycine Max | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Type I collagen | Beckton Dickinson | 354236 | |
| Waymouth’s medium | Gibco | 31220-023 |
Referências
- Lardon, J., Bouwens, L. Metaplasia in the pancreas. Differentiation. 73, 278-286 (2005).
- Sphyris, N., Logsdon, C. D., Harrison, D. J. Improved retention of zymogen granules in cultured murine pancreatic acinar cells and induction of acinar-ductal transdifferentiation in vitro. Pancreas. 30, 148-157 (2005).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 3028-3032 (1972).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. I. Dissociation technique and morphologic characteristics of separated cells. J. Cell. Biol. 63, 1037-1056 (1974).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. II. Functional characteristics of separated cells. J. Cell. Biol. 63, 1057-1073 (1974).
- Schultz, G. S., et al. Guinea pig pancreatic acini prepared with purified collagenase. Exp. Cell Res. 130, 49-62 (1980).
- Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini. Am. J. Physiol. 235, 517-524 (1978).
- Logsdon, C. D., Williams, J. A. Epidermal growth factor binding and biologic effects on mouse pancreatic acini. Gastroenterology. 85, 339-345 (1983).
- Han, B., Logsdon, C. D. Cholecystokinin induction of mob-1 chemokine expression in pancreatic acinar cells requires NF-kappaB activation. Am. J. Physiol. 277, 74-82 (1999).
- Ji, B., Kopin, A. S., Logsdon, C. D. Species differences between rat and mouse CCKA receptors determine the divergent acinar cell response to the cholecystokinin analog JMV-180. J. Biol. Chem. 275, 19115-19120 (2000).
- Ji, K. A., Yang, M. S., Jou, I., Shong, M. H., Joe, E. H. Thrombin induces expression of cytokine-induced SH2 protein (CIS) in rat brain astrocytes: involvement of phospholipase A2, cyclooxygenase, and lipoxygenase. Glia. 48, 102-111 (2004).
- Gaiser, S., et al. Intracellular activation of trypsinogen in transgenic mice induces acute but not chronic pancreatitis. Gut. 60, 1379-1388 (2011).
- Logsdon, C. D., Williams, J. A. Pancreatic acinar cells in monolayer culture: direct trophic effects of caerulein in vitro. Am. J. Physiol. 250, 440-447 (1986).
- Stanger, B. Z., Dor, Y. Dissecting the cellular origins of pancreatic cancer. Cell Cycle. 5, 43-46 (2006).
- Vincent, D. F., et al. Tif1gamma suppresses murine pancreatic tumoral transformation by a smad4-independent pathway. Am. J. Pathol. 180, 2214-2221 (2012).
- Vincent, D. F., et al. Inactivation of TIF1gamma cooperates with Kras to induce cystic tumors of the pancreas. PLoS Genet. 5, e1000575 (2009).
- Dorrell, C., et al. Isolation of mouse pancreatic alpha, beta, duct and acinar populations with cell surface markers. Mol. Cell Endocrinol. 339, 144-150 (2011).
- Case, R. M. Synthesis, intracellular transport and discharge of exportable proteins in the pancreatic acinar cell and other cells. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 53, 211-354 (1978).
- Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype. Eur. J. Cell. Biol. 90, 1052-1060 (2011).
