माउस प्राथमिक अग्नाशय कोष्ठकी कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति
Summary
इस प्रकाशन में, हम अलग और murine अग्न्याशय से संवर्धन प्राथमिक अग्नाशय कोष्ठकी कोशिकाओं के लिए एक तेजी से और सुविधाजनक प्रक्रिया का वर्णन. इस विधि ताजा प्राथमिक untransformed / सामान्य बहि अग्नाशय कोशिकाओं के शरीर क्रिया विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान दृष्टिकोण का गठन किया.
Abstract
इस प्रोटोकॉल यह संभव अधिक से अधिक एक सप्ताह के लिए उन्हें संस्कृति में बनाए रखने के लिए कर रही है, murine अग्नाशय acini का तेजी से अलगाव (कम से कम 1 घंटे में) परमिट. 20 से अधिक एक्स 10 6 कोष्ठकी कोशिकाओं को एक एकल murine अग्न्याशय से प्राप्त किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल स्वतंत्र रूप से समानांतर में के रूप में कई के रूप में 10 pancreases संसाधित करने के लिए संभावना प्रदान करता है. यह कोष्ठकी वास्तुकला को बरकरार रखता है, क्योंकि इस मॉडल अच्छी तरह से उनके कोष्ठकी भेदभाव के आंशिक या कुल नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप कई आनुवंशिक परिवर्तन प्रदर्शित जो अग्नाशय के ट्यूमर से स्थापित सेल लाइनों के विपरीत इन विट्रो में बहि अग्न्याशय के शरीर क्रिया विज्ञान के अध्ययन के लिए उपयुक्त है.
Introduction
बहिःस्त्रावी अग्नाशय के ऊतकों पर काम कर अनुसंधान प्रयोगशालाओं के लिए एक अक्सर सामना करना पड़ा समस्या काफी लंबे समय से एक लंबे समय तक प्रयोग अनुमति देने के लिए समय की अवधि के लिए इन विट्रो में कोष्ठकी कोशिकाओं की खेती की कठिनाई है.
ऐसी संस्कृति प्रणालियों के विकास impeding एक पहलू है कि वे अग्नाशय कोशिकाओं के अलगाव के दौरान जारी किया जाता है जब सचमुच अग्नाशय के ऊतकों को पचाने, जो ग्लाइकोलाइटिक प्रोटियोलिटिक, और lipolytic एंजाइमों, में उच्च सामग्री के कारण प्रयोगात्मक हेरफेर करने के अग्नाशय के ऊतकों की आंतरिक संवेदनशीलता है.
एक दूसरा पहलू उनके स्रावी विशेषताओं खो देते हैं और इस तरह के अग्नाशय ductal कोशिकाओं या hepatocyte कोशिकाओं की तरह 1. के रूप में अन्य परिपक्व कोशिकाओं, transdifferentiate के लिए करते हैं जो कोष्ठकी कोशिकाओं की इन विट्रो plasticity में उल्लेखनीय है इन विट्रो में, इस सेल plasticity के प्रयोगात्मक शर्तों के साथ बदलता रहता है (जैसे संस्कृति के माध्यम संरचना के रूप में) 2 </> समर्थन और बहिःस्त्रावी अग्नाशय कोशिकाओं 1 के लिए उपयुक्त संस्कृति शर्तों के डिजाइन में जटिलता की एक डिग्री का परिचय.
कई तरीकों पहली गिनी पिग अग्न्याशय 3-5 से कोष्ठकी कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति के लिए विकसित किया गया है. प्रारंभ में, उन प्रोटोकॉल जोरदार यांत्रिक हदबंदी से परम अलगाव के साथ, collagenase, काइमोट्रिप्सिन, और एक प्रोटीज कॉकटेल के साथ अग्नाशय के ऊतकों की पाचन शामिल किया गया. इस तरह से अलग अग्नाशय कोशिकाओं को विशेष रूप से असामान्य संरचनात्मक और कार्यात्मक विशेषताओं, शिखर संरचनाओं और उनके झिल्ली रिसेप्टर्स के लिए महत्वपूर्ण नुकसान का नुकसान प्रदर्शित किया. अलग कक्षों केवल 1 या 2 दिन के लिए व्यवहार्य बने रहे.
की तैयारी acini secretagogues 6-8 के जवाब में सतह रिसेप्टर्स को क्षति को सीमित करने, और इस तरह बहि: स्राव में सुधार, कोशिका झिल्ली के संरक्षण, उनके अंतर और कहनेवाला वास्तुकला का कहना है छितरी हुई है. एक resu के रूप मेंलेफ्टिनेंट, इस विधि इन विट्रो में 7-10 दिन तक कोष्ठकी सेल व्यवहार्यता को विस्तार देने का प्रमुख लाभ प्रदान करता है. अंतराल जंक्शनों से सेल युग्मन सहित कहनेवाला संपर्कों के रखरखाव बहिःस्त्रावी अग्नाशय कोष्ठकी सेल phenotype 13 साल की एक आवश्यक कारक है क्योंकि इसके अलावा, इस पद्धति वर्तमान में 9-12 कोष्ठकी सेल अलगाव को पसंद किया जाता है.
कोष्ठकी कोशिकाओं और ductal कोशिकाओं को उनके transdifferentiation की dedifferentiation आक्रामक बहिःस्त्रावी अग्नाशय के कैंसर 14 साल की उत्पत्ति के लिए प्रस्तावित तंत्र में से एक है, के रूप में छितरी acini मॉडल भी अग्नाशय plasticity और इसके बाद के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक पर्याप्त व्यवस्था है. इसके अलावा, आनुवंशिक रूप से संशोधित पशुओं 15,16 के उपयोग और जीन स्थानांतरण तकनीक का विकास (adenoviral 2 या lentiviral पारगमन, नैनोकणों, आदि का उपयोग) के साथ संयोजन में इस विट्रो प्राथमिक कोष्ठकी सेल मॉडल में कर सकते हैंविभिन्न आनुवंशिक रोग कोष्ठकी सेल भेदभाव या dedifferentiation के विनियमन को प्रभावित और pancreatitis की शुरुआत, precancerous घावों, और सेल plasticity में परिवर्तन के लिए जिम्मेदार आणविक घटनाओं की बेहतर समझ प्रदान करना चाहिए कि कैसे निर्धारित करने में बहुत उपयोगी हो सकता है.
छितरी acini के अलगाव हम संस्कृति अग्नाशय कोष्ठकी कोशिकाओं को हमारी प्रयोगशाला में उपयोग दृष्टिकोण है. हम यहाँ का वर्णन है और प्रयोग विधि पर चर्चा की. यह कोष्ठकी कोशिकाओं की हदबंदी के बिना यांत्रिक विघटन करने के लिए मिलकर अग्नाशय के ऊतकों (एक जीवाणु collagenase साथ) के enzymatic पृथक्करण शामिल है. सबसे प्रोटोकॉल निलंबन में या विशेष इलाज प्लास्टिक substrates पर या तो संवर्धन acini, शामिल हैं, हम लंबे समय तक सेल संस्कृति आवश्यक है, तो मैट्रिक्स scaffolds पर बाद में उन्हें बोने, केवल कुछ समय (24 घंटे के लिए) निलंबन में उन्हें विकसित.
इस प्रोटोकॉल छितरी अग्नाशय एसी का तेजी से अलगाव (कम से कम 1 घंटे में) की अनुमति देता हैपहल, संस्कृति में एक से अधिक सप्ताह के लिए स्थायी. यह माउस अग्न्याशय के अनुसार 20 से अधिक एक्स 10 6 कोष्ठकी कोशिकाओं के अलगाव की अनुमति देता है. अपनी सादगी यह संभव स्वतंत्र रूप से समानांतर में के रूप में कई के रूप में 10 pancreases प्रक्रिया को बनाता है. वर्तमान में उपलब्ध अन्य सभी बहिःस्त्रावी अग्नाशय मॉडल कई आनुवंशिक प्रदर्शित अग्नाशय के ट्यूमर से प्राप्त कर रहे हैं के रूप में acini का अंतर और कहनेवाला वास्तुकला और इस प्रकार पृथक प्राथमिक कोशिकाओं की कोष्ठकी phenotype बनाए रखने से, इस मॉडल, transdifferentiation तंत्र के अध्ययन के लिए पसंद की एक प्रणाली का गठन परिवर्तन सेलुलर परिवर्तन के लिए अग्रणी.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हम अग्नाशय कोष्ठकी कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन. यह विधि कम से कम 1 घंटे में प्रति पशु 20 से अधिक एक्स 10 6 कोष्ठकी कोशिकाओं को अलग करने के लिए संभव बनाता है. अपनी तेज…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम जानवरों की देखभाल के साथ अपने तकनीकी सहायता के लिए AniCan के कर्मचारियों (CRCL, ल्यों) धन्यवाद. इस काम एसोसिएशन डालना ला Recherche सुर ले कैंसर के अनुसार, संस्थान नेशनल डु कैंसर से, और से फैलोशिप द्वारा संस्थान नेशनल डे ला Sante एट डी ला Recherche médicale (INSERM Avenir कार्यक्रम), लीग नेशनल Contre ले कैंसर, द्वारा समर्थित किया गया फ्रांस के Ministère डे ल Enseignement Supérieur एट डी ला Recherche से संस्थान नेशनल डु कैंसर (जेजी), (आरएमपी और DFV) से और एसोसिएशन डालना ला Recherche सुर ले कैंसर से लीग नेशनल Contre ले कैंसर (जेजी), ( DFV).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Dutscher | 146560 | |
| 10 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357551 | |
| 100 μm filter | Beckton Dickinson | 352360 | |
| 100 mm Petri dish | Beckton Dickinson | 353003 | |
| 1000 μl filter tips | Starlab | S1122-1830 | |
| 20 μl filter tips | Starlab | S1120-1810 | |
| 200 μl filter tips | Starlab | S1120-8810 | |
| 25 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357535 | |
| 5 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357543 | |
| 50 ml polypropylene tube | Beckton Dickinson | 352070 | |
| 6-well plate | Beckton Dickinson | 353046 | |
| Acetic acid 100% | VWR BDH Prolabo | 20104.298 | |
| Collagenase IA | Sigma-Aldrich | C2676 | |
| Curved forceps, Dumont #7 | World Precision Instruments | 14188 | To sterilize before use |
| Dissecting scissors, straight | World Precision Instruments | 14393 | To sterilize before use |
| Epidermal Growth Factor, human | Promokine | C-60180 | |
| Ethanol absolute (AnalaR Normapur) | VWR BDH Prolabo | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| Forceps, Dumont #5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Hank’s Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14025050 | |
| HEPES 1 M (pH 6.98-7.30) | Lonza | 17-737F | |
| Incubator O2/CO2 | Sanyo | MCO-19M | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Matrigel | Beckton Dickinson | 356234 | |
| Microbiological Safety Cabinet, level II | Faster | SafeFast Elite 212 S | |
| Noyes scissors, sharp/sharp tips, German | World Precision Instruments | 500228-G | To sterilize before use |
| Penicillin-Streptomycin mixture | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffer Saline 10x | Gibco | 14200067 | |
| Pipet-Aid | Drummond Scientific Company | Pipet-Aid XP | |
| Pipetman P1000 | Gilson | F123602 | |
| Pipetman P20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P200 | Gilson | F123601 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Scalpel | Paramount Surgimed Ltd. | Disposable Scalpel Size 23 | |
| T25 flask, 25 cm2 | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| Trypsin inhibitor, from Glycine Max | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Type I collagen | Beckton Dickinson | 354236 | |
| Waymouth’s medium | Gibco | 31220-023 |
Referências
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