Isolamento e Cultura do mouse primárias células pancreáticas acinares
Summary
Nesta publicação, é descrito um procedimento rápido e conveniente para o isolamento e cultura de células acinares pancreáticas primárias do pâncreas murino. Este método constitui uma ferramenta valiosa para o estudo da fisiologia das células primárias normais do pâncreas fresco / não transformada exócrinas.
Abstract
Este protocolo permite o isolamento rápido (em menos de 1 hora) de ácinos pancreáticos de murino, tornando possível mantê-las em cultura durante mais de uma semana. Mais de 20 x 10 6 células acinares podem ser obtidas a partir de um único pâncreas murino. Este protocolo oferece a possibilidade de processar independentemente tantos como 10 pâncreas em paralelo. Porque preserva arquitectura acinar, este modelo é bem adequado para o estudo da fisiologia do pâncreas exócrino, in vitro, em contraste com as linhas de células estabelecidas a partir de tumores pancreáticos, que exibem muitas alterações genéticas, resultando em perda parcial ou total da sua diferenciação acinar.
Introduction
Um problema frequentemente encontrado para laboratórios de investigação úteis em tecido pancreático exócrino é a dificuldade de se cultivar células acinares in vitro durante um período de tempo suficientemente longo para permitir uma experiência de longa duração.
Um factor impedindo o desenvolvimento de tais sistemas de cultura representa a sensibilidade intrínseca do tecido pancreático para manipulação experimental devido ao elevado teor em glicolíticas, proteolítica, lipolítica e de enzimas, que literalmente digerir o tecido pancreático, quando eles são libertados durante o isolamento das células pancreáticas.
Um segundo factor é a notável na plasticidade in vitro de células acinares, que tendem a perder as suas características de secreção e transdiferenciam a outras células maduras, tais como células do ducto pancreático hepatócitos ou células do tipo 1. In vitro, este plasticidade das células varia de acordo com as condições experimentais (tais como composição do meio de cultura) 2 </sup> e apresenta um grau de complexidade no design das condições de cultivo apropriadas para células pancreáticas exócrinas 1.
Vários métodos têm sido desenvolvidos para o isolamento e cultura de células acinares, primeiro a partir do pâncreas de porco da guiné 3-5. Inicialmente, esses protocolos envolvidos digestão do tecido pancreático com colagenase, quimotripsina, e um cocktail de protease, com isolamento final por dissociação mecânica vigorosa. As células pancreáticas isoladas desta forma exibido características estruturais e funcionais anormais, nomeadamente uma perda de estruturas apicais e danos significativos aos seus receptores de membrana. Células isoladas permaneceu viável por apenas 1 ou 2 dias.
Preparação de ácinos dispersos mantém a sua arquitectura intra e intercelular, preservando as membranas celulares, limitando os danos para os receptores da superfície e, assim, melhorar a secreção exócrina em resposta a secreção de 6-8. Como result, este método oferece a grande vantagem de prolongar a viabilidade das células acinares de 7-10 dias in vitro. Além disso, este método é actualmente preferido para isolamento de células acinares 9-12, porque a manutenção de contactos intercelulares, incluindo o acoplamento por junções de hiato célula, é um determinante essencial da pancreática exócrina acinar fenótipo celular 13.
À medida que a desdiferenciação de células acinares e do seu transdiferenciação de células ductais é um dos mecanismos propostos para a génese de cancros agressivos pancreáticas exócrinas 14, o modelo ácinos dispersos é também um sistema adequado para estudar a plasticidade do pâncreas e dos seus mecanismos moleculares subsequentes. Além disso, em combinação com a utilização de animais geneticamente modificados 15,16 e o desenvolvimento de técnicas de transferência de genes (adenovirais 2 ou transdução lentiviral, da utilização de nanopartículas, etc), neste modelo in vitro de células acinares primário podeser muito útil na determinação de como diversas disfunções genéticas afectam a regulação da diferenciação de células acinares, ou de desdiferenciação, e deverá proporcionar uma melhor compreensão dos eventos moleculares responsáveis pelo início da pancreatite, lesões pré-cancerosas, e as alterações na plasticidade celular.
Isolamento de ácinos dispersos é a abordagem usamos no nosso laboratório para cultura de células acinares pancreáticas. Nós aqui descrever e discutir o método utilizado. Ele envolve a dissociação enzimática de tecido pancreático (com uma colagenase bacteriana), acoplado ao rompimento mecânico, sem dissociação de células acinares. Enquanto a maioria dos protocolos envolvem a cultura do ácinos, em suspensão ou em substratos de plástico com tratamento especial, nós cultivá-las em suspensão apenas brevemente (por 24 horas), semeando-los depois para andaimes matriz se cultura de células prolongada é necessária.
Este protocolo permite o isolamento rápido (em menos de 1 hora) de corrente alternada dispersos de pâncreasini, sustentável durante mais de uma semana de cultura. Ele permite o isolamento de mais de 20 x 10 6 por células acinares do pâncreas do rato. A sua simplicidade permite processar independentemente tantos como 10 pâncreas em paralelo. Ao manter a arquitectura intra e intercelular de ácinos e assim o fenótipo das células acinares primárias isoladas, este modelo constitui um sistema de escolha para o estudo de mecanismos de transdiferenciação, como todos os outros modelos pancreáticas exócrinas actualmente disponíveis são derivadas de tumores pancreáticos exibindo muitos genética alterações que levam a transformação celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, descrevemos um procedimento para isolar células acinares pancreáticas. Este método torna possível isolar mais do que 20 x 10 6 células acinares por animal, em menos de 1 hora. Graças à sua implementação rápida e simples (até 10 pâncreas podem ser processados de forma independente por cada experiência em paralelo), este protocolo surge como um bom compromisso entre métodos de isolamento existentes 3-5,9-12,17.
Etapas críticas / r…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao pessoal da AniCan (CRCL, Lyon) para a sua assistência técnica com cuidado animal. Este trabalho foi apoiado pelo Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (Programa Avenir INSERM), o Ligue Nationale Contre le Câncer, pela Associação pour la Recherche sur le Cancer, pelo Institut National du Cancer, e por bolsas de o Ligue Nationale Contre le Cancer (JG), a partir do Institut National du Cancer (JG), a partir do Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche de França (PGR e DFV) e da Associação pour la Recherche sur le Cancer ( DFV).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Dutscher | 146560 | |
| 10 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357551 | |
| 100 μm filter | Beckton Dickinson | 352360 | |
| 100 mm Petri dish | Beckton Dickinson | 353003 | |
| 1000 μl filter tips | Starlab | S1122-1830 | |
| 20 μl filter tips | Starlab | S1120-1810 | |
| 200 μl filter tips | Starlab | S1120-8810 | |
| 25 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357535 | |
| 5 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357543 | |
| 50 ml polypropylene tube | Beckton Dickinson | 352070 | |
| 6-well plate | Beckton Dickinson | 353046 | |
| Acetic acid 100% | VWR BDH Prolabo | 20104.298 | |
| Collagenase IA | Sigma-Aldrich | C2676 | |
| Curved forceps, Dumont #7 | World Precision Instruments | 14188 | To sterilize before use |
| Dissecting scissors, straight | World Precision Instruments | 14393 | To sterilize before use |
| Epidermal Growth Factor, human | Promokine | C-60180 | |
| Ethanol absolute (AnalaR Normapur) | VWR BDH Prolabo | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| Forceps, Dumont #5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Hank’s Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14025050 | |
| HEPES 1 M (pH 6.98-7.30) | Lonza | 17-737F | |
| Incubator O2/CO2 | Sanyo | MCO-19M | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Matrigel | Beckton Dickinson | 356234 | |
| Microbiological Safety Cabinet, level II | Faster | SafeFast Elite 212 S | |
| Noyes scissors, sharp/sharp tips, German | World Precision Instruments | 500228-G | To sterilize before use |
| Penicillin-Streptomycin mixture | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffer Saline 10x | Gibco | 14200067 | |
| Pipet-Aid | Drummond Scientific Company | Pipet-Aid XP | |
| Pipetman P1000 | Gilson | F123602 | |
| Pipetman P20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P200 | Gilson | F123601 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Scalpel | Paramount Surgimed Ltd. | Disposable Scalpel Size 23 | |
| T25 flask, 25 cm2 | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| Trypsin inhibitor, from Glycine Max | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Type I collagen | Beckton Dickinson | 354236 | |
| Waymouth’s medium | Gibco | 31220-023 |
Referências
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