Isolering och odling av mus Primära bukspottkörtel Acinar
Summary
I denna skrift beskriver vi en snabb och bekväm förfarande för isolering och odling av primära pankreasceller acinösa från murina bukspottkörteln. Denna metod utgör en värdefull metod för att studera fysiologi färska primära normala / otransformerad exokrina celler i bukspottkörteln.
Abstract
Detta protokoll möjliggör snabb isolering (på mindre än 1 timme) av murina pankreaskörtelgång, vilket gör det möjligt att bevara dem i kultur för mer än en vecka. Mer än 20 x 10 6 acinar celler kan erhållas från en enda mus bukspottkörteln. Detta protokoll ger möjlighet att självständigt behandla så många som 10 pancreases parallellt. Eftersom det bevarar acinar arkitektur, är denna modell väl lämpad för att studera fysiologi exokrina pankreas in vitro i motsats till cellinjer etablerade från pankreas tumörer, som visar många genetiska förändringar som leder till partiell eller total förlust av sin acinar differentiering.
Introduction
Ett ofta förekommande problem för forskningslaboratorier arbetar på exokrin pankreas vävnad är svårigheten att odla acinarceller celler in vitro under en tidsperiod tillräckligt lång för att möjliggöra ett långsiktigt experiment.
En faktor som hindrar utvecklingen av sådana odlingssystem är den inneboende känslighet pankreasvävnad till experimentell manipulation på grund av den höga halten i glykolytiska, proteolytiska och lipolytiska enzymer, som bokstavligen smälta pankreasvävnad när de släpps under isoleringen av celler i bukspottkörteln.
En andra faktor är anmärkningsvärt in vitro plasticitet körtelceller, som tenderar att förlora sina sekretoriska egenskaper och transdifferentiera till andra mogna celler, såsom pankreas duktal celler eller hepatocyte-liknande celler 1. In vitro, varierar denna cell plasticitet med de experimentella förhållanden (t.ex. odlingsmedium sammansättning) 2 </sup> och introducerar en grad av komplexitet i utformningen av lämpliga odlingsbetingelser för exokrina bukspottkörtelns celler 1.
Flera metoder har utvecklats för isolering och odling av acinära celler, först från marsvin bukspottkörteln 3-5. Inledningsvis dessa protokoll inblandade nedbrytning av bukspottkörtelns vävnad med kollagenas, kymotrypsin, och ett proteas cocktail, med ultimat isolering genom kraftig mekanisk dissociation. Bukspottkörtelns celler som isolerats på detta sätt visade onormala strukturella och funktionella egenskaper, särskilt en förlust av apikala strukturer och betydande skador på sina membranreceptorerna. Isolerade celler förblev lönsamt för endast 1 eller 2 dagar.
Framställning av spridda acini upprätthåller deras intra-och intercellulära arkitektur, bevara cellmembran, begränsa skador på ytan receptorer, och därmed förbättra exokrin sekretion svar på sekretagoger 6-8. Som ett resuLT, erbjuder denna metod den stora fördelen att utvidga viabilitet acinar cell till 7-10 dagar in vitro. Dessutom är denna metod som för närvarande föredrog att körtelcell isolering 9-12 eftersom underhåll av intercellulära kontakter, inklusive cell koppling genom gap junctions, är en viktig faktor för den exokrina pankreas acinar cellfenotyp 13.
Som dedifferentiering av acinar celler och deras transdifferentiering till duktal celler är en av de föreslagna mekanismerna för uppkomsten av aggressiva exokrina pankreas cancer 14, är den spridda acini modellen också ett lämpligt system för att studera bukspottkörtel plasticitet och dess efterföljande molekylära mekanismer. Dessutom, i kombination med användning av genetiskt modifierade djur 15,16 och utveckling av genöverföringstekniker (adenovirus 2 eller lentiviral transduktion, användning av nanopartiklar, etc), detta in vitro primära körtelcell modellen kanvara mycket användbar för att bestämma hur olika genetiska dysfunktioner påverkar regleringen av körtelcell differentiering eller dedifferentiering och bör ge bättre förståelse av de molekylära händelser som är ansvariga för uppkomsten av pankreatit, precancerösa lesioner, och förändringar i cellens plasticitet.
Isolering av spridda acini är den metod vi använder i vårt laboratorium för att acinära kultur pankreasceller. Vi beskriver här och diskutera den metod som används. Det innebär enzymatisk dissociation av bukspottskörteln vävnad (med en bakteriell kollagenas) kopplad till mekanisk sönderdelning utan dissociation av körtelceller. Medan de flesta protokollen omfattar odling av acini, antingen i suspension eller på specialbehandlade plast substrat, odlar vi dem i suspension endast kort (under 24 timmar), sådd dem efteråt på matrisstöttor om långvarig cellodling krävs.
Detta protokoll möjliggör snabb isolering (på mindre än 1 timme) av spridda bukspottkörtel acini, hållbart för mer än en vecka i kultur. Den tillåter isolering av mer än 20 x 10 6 acinar celler per mus bukspottkörteln. Dess enkelhet gör det möjligt att bearbeta självständigt så många som 10 pancreases parallellt. Genom att upprätthålla den intra-och intracellulär arkitektur acini och därmed acinar fenotypen av isolerade primära celler, utgör denna modell ett valfrihetssystem för studier av transdifferentiering mekanismer, som alla andra exokrina pankreas modeller tillgängliga härrör från pankreastumörer visar många genetiska förändringar som leder till cellulär transformation.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta protokoll, beskriver vi ett förfarande för isolering av celler i bukspottkörteln acinar. Denna metod gör det möjligt att isolera mer än 20 x 10 6 acinar celler per djur på mindre än en timme. Tack vare sin snabba och enkla implementering (så många som 10 pancreases kan självständigt bearbetas per experiment parallellt), verkar detta protokoll som en bra kompromiss mellan de befintliga isoleringsmetoder 3-5,9-12,17.
Kritiska steg / felsökning</em…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka personalen för AniCan (CrCL, Lyon) för deras tekniskt bistånd med djurvård. Detta arbete stöddes av Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM Avenir Program), Ligue Nationale Contre le Cancer, av Association pour la Recherche sur le Cancer, av Institut National du Cancer, och genom stipendier från Ligue Nationale Contre le Cancer (JG), från Institut National du Cancer (JG), från Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche av Frankrike (RMP och DFV) och från Association pour la Recherche sur le Cancer ( DFV).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Dutscher | 146560 | |
| 10 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357551 | |
| 100 μm filter | Beckton Dickinson | 352360 | |
| 100 mm Petri dish | Beckton Dickinson | 353003 | |
| 1000 μl filter tips | Starlab | S1122-1830 | |
| 20 μl filter tips | Starlab | S1120-1810 | |
| 200 μl filter tips | Starlab | S1120-8810 | |
| 25 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357535 | |
| 5 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357543 | |
| 50 ml polypropylene tube | Beckton Dickinson | 352070 | |
| 6-well plate | Beckton Dickinson | 353046 | |
| Acetic acid 100% | VWR BDH Prolabo | 20104.298 | |
| Collagenase IA | Sigma-Aldrich | C2676 | |
| Curved forceps, Dumont #7 | World Precision Instruments | 14188 | To sterilize before use |
| Dissecting scissors, straight | World Precision Instruments | 14393 | To sterilize before use |
| Epidermal Growth Factor, human | Promokine | C-60180 | |
| Ethanol absolute (AnalaR Normapur) | VWR BDH Prolabo | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| Forceps, Dumont #5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Hank’s Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14025050 | |
| HEPES 1 M (pH 6.98-7.30) | Lonza | 17-737F | |
| Incubator O2/CO2 | Sanyo | MCO-19M | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Matrigel | Beckton Dickinson | 356234 | |
| Microbiological Safety Cabinet, level II | Faster | SafeFast Elite 212 S | |
| Noyes scissors, sharp/sharp tips, German | World Precision Instruments | 500228-G | To sterilize before use |
| Penicillin-Streptomycin mixture | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffer Saline 10x | Gibco | 14200067 | |
| Pipet-Aid | Drummond Scientific Company | Pipet-Aid XP | |
| Pipetman P1000 | Gilson | F123602 | |
| Pipetman P20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P200 | Gilson | F123601 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Scalpel | Paramount Surgimed Ltd. | Disposable Scalpel Size 23 | |
| T25 flask, 25 cm2 | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| Trypsin inhibitor, from Glycine Max | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Type I collagen | Beckton Dickinson | 354236 | |
| Waymouth’s medium | Gibco | 31220-023 |
Referências
- Lardon, J., Bouwens, L. Metaplasia in the pancreas. Differentiation. 73, 278-286 (2005).
- Sphyris, N., Logsdon, C. D., Harrison, D. J. Improved retention of zymogen granules in cultured murine pancreatic acinar cells and induction of acinar-ductal transdifferentiation in vitro. Pancreas. 30, 148-157 (2005).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 3028-3032 (1972).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. I. Dissociation technique and morphologic characteristics of separated cells. J. Cell. Biol. 63, 1037-1056 (1974).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. II. Functional characteristics of separated cells. J. Cell. Biol. 63, 1057-1073 (1974).
- Schultz, G. S., et al. Guinea pig pancreatic acini prepared with purified collagenase. Exp. Cell Res. 130, 49-62 (1980).
- Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini. Am. J. Physiol. 235, 517-524 (1978).
- Logsdon, C. D., Williams, J. A. Epidermal growth factor binding and biologic effects on mouse pancreatic acini. Gastroenterology. 85, 339-345 (1983).
- Han, B., Logsdon, C. D. Cholecystokinin induction of mob-1 chemokine expression in pancreatic acinar cells requires NF-kappaB activation. Am. J. Physiol. 277, 74-82 (1999).
- Ji, B., Kopin, A. S., Logsdon, C. D. Species differences between rat and mouse CCKA receptors determine the divergent acinar cell response to the cholecystokinin analog JMV-180. J. Biol. Chem. 275, 19115-19120 (2000).
- Ji, K. A., Yang, M. S., Jou, I., Shong, M. H., Joe, E. H. Thrombin induces expression of cytokine-induced SH2 protein (CIS) in rat brain astrocytes: involvement of phospholipase A2, cyclooxygenase, and lipoxygenase. Glia. 48, 102-111 (2004).
- Gaiser, S., et al. Intracellular activation of trypsinogen in transgenic mice induces acute but not chronic pancreatitis. Gut. 60, 1379-1388 (2011).
- Logsdon, C. D., Williams, J. A. Pancreatic acinar cells in monolayer culture: direct trophic effects of caerulein in vitro. Am. J. Physiol. 250, 440-447 (1986).
- Stanger, B. Z., Dor, Y. Dissecting the cellular origins of pancreatic cancer. Cell Cycle. 5, 43-46 (2006).
- Vincent, D. F., et al. Tif1gamma suppresses murine pancreatic tumoral transformation by a smad4-independent pathway. Am. J. Pathol. 180, 2214-2221 (2012).
- Vincent, D. F., et al. Inactivation of TIF1gamma cooperates with Kras to induce cystic tumors of the pancreas. PLoS Genet. 5, e1000575 (2009).
- Dorrell, C., et al. Isolation of mouse pancreatic alpha, beta, duct and acinar populations with cell surface markers. Mol. Cell Endocrinol. 339, 144-150 (2011).
- Case, R. M. Synthesis, intracellular transport and discharge of exportable proteins in the pancreatic acinar cell and other cells. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 53, 211-354 (1978).
- Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype. Eur. J. Cell. Biol. 90, 1052-1060 (2011).
