Agroinfiltration كفاءة من النباتات للتعبير عابر الرفيع المستوى من البروتينات المؤتلف
Summary
النباتات توفر نظام رواية لإنتاج البروتينات الدوائية على نطاق تجاري وهذا هو أكثر استيعابا، فعالة من حيث التكلفة وآمنة من نماذج التعبير الحالي. في هذه الدراسة، ونحن التقرير مقاربة بسيطة ومريحة، وحتى الآن قابلة لإدخال الجينات التي تحتوي على الهدف<em> الأجرعية المورمة</em> في النباتات على البروتين التعبير عابر.
Abstract
ثقافة خلايا الثدييات هو المنصة الرئيسية للإنتاج التجاري من اللقاحات البشرية والبروتينات العلاجية. ومع ذلك، فإنه لا يمكن تلبية الطلب المتزايد في جميع أنحاء العالم للادوية، نظرا لقابلية محدودة والتكلفة العالية. وقد أظهرت النباتات لتكون واحدة من أكثر واعدة منصات إنتاج الأدوية البديلة التي هي قوية وقابلة للتطوير، منخفضة التكلفة وآمنة. وقد سمح التطور الأخير من ناقلات القائم على فيروس التعبير عابر سريع وعلى مستوى عال من البروتينات المؤتلف في النباتات. لمزيد من تعظيم فائدة من نظام التعبير عابرة، ونحن يبرهن على وجود منهجية بسيطة وفعالة وقابلة للتطوير لإدخال الجينات التي تحتوي على الهدف الأجرعية في الأنسجة النباتية في هذه الدراسة. نتائجنا تشير إلى أن agroinfiltration مع كل حقنة والفراغ وأسفرت الأساليب في مقدمة كفاءة الأجرعية في الأوراق وإنتاج قوي من اثنين من البروتينات الفلورية؛ GFP وDsRed. وعلاوة على ذلك،ونحن لشرح المزايا الفريدة التي توفرها كلا الأسلوبين. تسلل حقنة بسيطة ولا تحتاج إلى معدات باهظة الثمن. كما يسمح للمرونة إما اختراق إجازة كامل مع الجين المستهدف واحد، أو لإدخال جينات من أهداف متعددة على ورقة واحدة. وهكذا، فإنه يمكن استخدامها لمختبر التعبير مقياس من البروتينات المؤتلف وكذلك لمقارنة البروتينات أو نواقل مختلفة لمحصول أو التعبير حركية. بساطة تسلل حقنة أيضا تقترح فائدتها في المدرسة الثانوية والتعليم الجامعي لموضوع التكنولوجيا الحيوية. في المقابل، تسلل الفراغ هو أكثر قوة ويمكن زيادتها الى أعلى لتصنيع التجارية من البروتينات الدوائية. فإنه يوفر أيضا ميزة كونها قادرة على agroinfiltrate الأنواع النباتية التي ليست قابلة للتسلل حقنة مثل الخس ونبات الأرابيدوبسيس. وعموما، فإن الجمع بين حقنة وagroinfiltration فراغ يوفر الباحثين والمربين بسيطة وفعالة وقويةمنهجية لعابر التعبير البروتين. وسيسهل بشكل كبير في تطوير البروتينات الدوائية وتعزيز تعليم العلوم.
Introduction
منذ 1970s، تم استكشاف النباتات كبدائل للالثدييات، الحشرات، والبكتيرية مزارع الخلايا لإنتاج التجاري من البروتينات المؤتلف والتداوي البروتين 1. وقد أظهرت أنظمة المستندة إلى النباتات للتعبير عن المستحضرات الصيدلانية البيولوجية واعدة في السنوات الأخيرة، حيث العديد من العلاجات رواية للأمراض، مثل مرض غوشيه 2، وإنفلونزا الطيور H5N1 3، وقد أظهرت نجاح في التجارب السريرية. وقد خلق وضع آليات المختصة للتعبير البروتين المؤتلف في النباتات في العقود التي تلت تلك التجارب الأولية المحتملة للأنظمة المستندة إلى النباتات لتغيير النموذج الحالي للإنتاج البروتين لثلاثة أسباب رئيسية. أولا، هناك انخفاض ملحوظ في التكاليف على النحو المفاعلات الحيوية الثدييات، الحشرات، والبكتيرية تتطلب تكاليف كبيرة بدء التشغيل، وسائط النمو باهظة الثمن، وعمليات معقدة لتنقية المصب 4. إنشاء مصنع المعدلة وراثيا مستقرةخطوط أيضا تتيح لهم التفوق على قابلية نظم التعبير الأخرى مثل البروتين النباتات معربا يمكن تزرع وتحصد على نطاق الزراعية 5. ثانيا، نظم التعبير المستندة إلى النباتات تقلل إلى حد كبير خطر انتقال العامل الممرض الإنسان أو الحيوان من المضيف البروتين، معربا عن البشر، مما يدل على التفوق في السلامة العامة 6. وأخيرا، والنباتات الاستفادة من نظام endomembrane حقيقية النواة مشابه لخلايا الثدييات، والسماح لمناسبة التعديل بعد متعدية من البروتينات بما في ذلك ارتباط بالغليكوزيل والجمعية من البروتينات متعددة الوحيدات 7. هذه القدرة يضع أنظمة المستندة إلى النباتات قبيل تلك التي تستند على أنظمة بدائية، مثل البكتيريا، لأن عددا أكبر من البروتينات المؤتلف الصيدلانية، بما في ذلك الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (MABS)، لديها بنية أكثر تعقيدا وتتطلب تعديلات واسعة ما بعد النقل أو التجميع 8.
هناك نوعان من APPRO الرئيسيةأوجاع إلى التعبير عن البروتينات المؤتلف في النباتات. الأول هو وضع خط ثابت المعدلة وراثيا، حيث يتم استنساخ الحمض النووي الترميز للبروتين الهدف إلى الكاسيت التعبير وأدخلت إما إلى الجينوم النووية أو بلاستيدات الخضراء. في القيام بذلك، يصبح الحمض النووي الأجنبية الموروثة من خلال الأجيال المتعاقبة، ويسمح لتحسن بشكل كبير والتدرجية، وأبعد من ذلك من أنظمة التعبير الأخرى 1. مقدمة من الحمض النووي الخارجية لالجينوم النووية ويتحقق عادة عن طريق عدوى الأجرعية المورمة من الأنسجة النباتية، أو أقل في كثير من الأحيان، عن طريق القصف microprojectile من النسيج 9. ثم يتم استخدام الهرمونات النباتية للحث على تمايز ونمو الأنسجة النباتية المعدلة وراثيا مثل الجذور والأوراق. لا يمكن أن يتحقق التحول من الجينوم بلاستيدات الخضراء مع A. المورمة، لكنها تعتمد كليا على الذهب أو التنغستن جسيمات المغلفة مع الحمض النووي أطلقت المقذوفات في الخلايا النباتية. الطريقة الثانية للتعبير عن recombinaNT البروتين في النباتات من خلال التعبير عابر 10. في هذا السيناريو، يتم تسليم ناقلات الفيروس المستمدة إيواء الجينات في المصالح عبر A. المورمة للنباتات تطويره بالكامل من خلال عملية تسمى agroinfiltration. بدلا من الاندماج في الجينوم المصنع، وبناء الجين تسليمها بعد ذلك تبدأ لتوجيه الإنتاج عابرة من البروتين المطلوب، والتي يمكن أن تحصد ومعزولة بعد فترة حضانة قصيرة. عابر التعبير الجيني يوفر ميزة أكبر تراكم البروتين الكلي فضلا عن الوقت تحسن من إنتاج البروتين، والنباتات سيكون جاهزا للحصاد ما يقرب من 1-2 أسابيع بعد agroinfiltration 11. هذا هو أسرع بكثير من عمليات توليد، والاختيار، وتأكيدا لخطوط النبات المعدلة وراثيا مستقرة، والتي يمكن أن يستغرق عدة أشهر إلى سنة. هذا ومع ذلك، هو أيضا الحد من نظام التعبير عابرة، لأنها لن تسفر مستقرة وراثيا النباتية لىNES التي يمكن استخدامها لتوليد بنك البذور للإنتاج التجاري على نطاق واسع. على الرغم من هذا، وقد وضعت مناهج لتحسين كبير التعبير عابر الحجم. نحن هنا لشرح أسلوب واحد من جيل من البروتين، معربا عن النباتات benthamiana نيكوتيانا عابر باستخدام ناقلات فيروسية فككت ألقاها أ. المورمة.
ويجري تطوير طريقتين الرئيسية لإيصال A. المورمة في الأنسجة النباتية: مقاعد البدلاء النطاق تسلل عبر حقنة وتسلل نطاق واسع عبر فراغ الغرفة. يتم وصف كل من البروتوكولات هنا باستخدام N. benthamiana، والذي يرتبط ارتباطا وثيقا نبات التبغ شيوعا، حيث أن النبات المضيف للتعبير عابر من اثنين من البروتينات الفلورية: البروتين الفلوري الأخضر (GFP) من قناديل البحر Aequorea فيكتوريا وبروتين أحمر فلوري من Discosoma المرجانية (DsRed) 12،13. N. benthamiana هو النبات العائل الأكثر شيوعا للالمؤتلف البروتين لأنها قابلة للتحول الجيني، يمكن أن تسفر عن كميات عالية من الكتلة الحيوية بسرعة، ومنتج البذور وافرة لإنتاج نطاق المتابعة 14. ميزة أخرى لاستخدام N. benthamiana بصفتها الدولة المضيفة للتعبير البروتين هو توافر مجموعة متنوعة من ناقلات التعبير 2،5. في هذه الدراسة، واثنين من ناقلات فيروسية فككت، واحدة على اساس فيروس فسيفساء التبغ (TMV) RNA نظام ريبليكون (ناقلات MagnICON) والأخرى المستمدة من الفول فيروس القزم الأصفر (BeYDV) DNA نظام ريبليكون (ناقلات geminiviral) 4،11، 15-18، وتستخدم لحمل الجينات وGFP DsRed وتسليمها إلى N. الخلايا benthamiana عبر A. وسوف تستخدم المورمة. ثلاثة بنيات الحمض النووي لGFP أو التعبير DsRed مع ناقلات MagnICON. وهي تشمل 5 'وحدة (pICH15879) التي تحتوي على المروج وعناصر وراثية أخرى لقيادة التعبير عن الجينات المستهدفة، 3' وحدة تحتوي على الجينات في المصالح (بيش-GFP أو بيش-DsRed)، وحدة integrase (pICH14011) الترميز للحصول على الانزيم الذي يجمع بين 5 'و 3' وحدات معا على التعبير 8،15. وهناك حاجة أيضا ثلاث بنيات الحمض النووي للتعبير مع ناقلات geminiviral. بالإضافة إلى ناقلات تحتوي على ريبليكون من الجين المستهدف (pBYGFP أو pBYDsRed)، متجه الترميز للبروتين النسخ المتماثل (pREP110) مطلوب من أجل التضخيم من الهدف ريبليكون 11،14،16. وعلاوة على ذلك، هو المطلوب إدراج ناقلات ترميز إسكات P19 القامع من الطماطم فيروس حيلة خطها لمستوى عال الهدف التعبير الجيني 11،16.
عموما هناك ثلاثة خطوات رئيسية لإدخال جينات البروتينات المؤتلف في خلايا النبات بواسطة agroinfiltration بما في ذلك نمو النبات، A. ثقافة المورمة إعداد، والتسلل. وتقدم كما في كل خطوة هو أمر حاسم لنجاح النهائي لهذا الإجراء، وبالتالي، وصفا مفصلا لكللكل من تسلل حقنة وتسلل الفراغ أدناه.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطلبات المتزايدة للادوية القائم على البروتين تتطلب في جميع أنحاء العالم منصات الإنتاج الجديدة التي هي قوية وقابلة للتطوير، منخفضة التكلفة وآمنة. وقد أظهرت النباتات لتكون واحدة من نظم الإنتاج البديلة الواعدة لإنتاج البروتين الصيدلانية. في السنوات الأخيرة، وتطوير …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر R. الشمس وغيرهم من الطلاب من مختبر تشن لمساهمتهم في محطة توليد المواد. نحن أيضا نشكر الدكتور D. الأخضر لدعمه من البحوث الجامعية في كلية التكنولوجيا والابتكار (سي تي أي). وأيد هذا البحث في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منح AI075549 U01 و1R21AI101329 إلى Q. تشن، ومنحة SSE من CTI من جامعة ولاية أريزونا إلى Q. تشن. K. يوزنغر، M. دنت، J. هورتادو، وJ. Stahnke هي طلاب المرحلة الجامعية بدعم من منحة SSE.
Materials
| Reagents | |||
| GFP | Invitrogen | V353-20 | www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008 |
| DsRed | Clontech | 632152 | www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000 |
| MagnICON Vector | Icon Genetics | n/a | www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006 |
| Geminiviral Vector | Author’s Lab | n/a | See reference: Chen and He, et al 2011 |
| N. benthamiana | Author’s Lab | n/a | herbalistics.com.au |
| Agrobacterium tumefaciens strain gv3101 | Author’s Lab | n/a | See reference: Lai and Chen 2012 |
| LB Agar Carbenicillin-100, plates | Sigma | L0418 | www.sigmaaldrich.com |
| LB Agar Kanamycin-50, plates | Sigma | L0543 | www.sigmaaldrich.com |
| Magnesium sulfate hepa hydrate | Sigma | M2773-500 g | www.sigmaaldrich.com |
| Bacto-Tryptone | Fisher | 73049-73-7 | www.fishersci.com |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dickinson & CO. | REF 212750 | www.bd.com |
| Difco Nutrient Broth | Becton, Dickinson & CO. | REF 234000 | www.bd.com |
| MES hydrate Buffer | Sigma | M8250-1kg | www.sigmaaldrich.com |
| Carbenicillin | Sigma | C1613-1ML | www.sigmaaldrich.com |
| Kanamycin | Sigma | 70560-51-9 | www.sigmaaldrich.com |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 221465 | www.sigmaaldrich.com |
| Jack’s Fertilizer | Hummert International | Jul-25 | www.hummert.com |
| Equipment | |||
| Vacuubrand MD4 Vacuum Pump | Fisher | 13-878-113 | www.fishersci.com |
| Vacuum Air Regulator Valve | Fisher | NC9386590 | www.fishersci.com |
| Desiccator 12 1/8″ with O ring | Fisher | 08-594-15C | www.fishersci.com |
| 3 L Tub | Rubber-Maid | n/a | Rubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work |
| plate/shelf 230ML | Fisher | NC9489269 | www.fishersci.com |
| Peat Pellet | Hummert International | 14-2370-1 | www.hummert.com |
| Propagation Tray Dome | hydrofarm | 132052 | www.hydroponics.net |
| Propagaiton Tray | hydrofarm | 138758 | www.hydroponics.net |
| Virbo Hand Seeder | Gro-Mor INC | n/a | www.gro-morent.com |
| Flora Cart 4 shelf | Hummert International | 65-6924-1 | www.hummert.com |
| 15 ml Round Bottom Culture Tubes | Sigma | CLS430172-500EA | http://www.sigmaaldrich.com |
| Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | www.bio-rad.com |
| Spectrophotometer Cuvettes | Bio-Rad | 223-9950 | www.bio-rad.com |
| Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | www.usascientific.com |
| Benchtop Centrifuge | Bio-Rad | 166-0602EDU | www.bio-rad.com |
| Incubator/Shaker | Eppendorf | Excella E25 | www.eppendorf.com |
| Ultraviolet Light Model#: UVGL-25 | UVP | 95-0021-12 | www.uvp.com |
References
- Chen, Q., Mou, B., Scorza, R. . Transgenic Horticultural Crops: Challenges and Opportunities – Essays by Experts. , 86-126 (2011).
- Chen, Q., Lai, H. Plant-derived virus-like particles as vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9, 26-49 (2013).
- Landry, N., et al. Preclinical and clinical development of plant-made virus-like particle vaccine against avian H5N1 influenza. PLoS One. 5, e15559 (2010).
- Lai, H., Chen, Q. Bioprocessing of plant-derived virus-like particles of Norwalk virus capsid protein under current Good Manufacture Practice regulations. Plant Cell Reports. 31, 573-584 (2012).
- Chen, Q. Expression and Purification of Pharmaceutical Proteins in Plants. Biological Engineering. 1, 291-321 (2008).
- Chen, Q. Turning a new leaf. European Biopharm. Rev. 2, 64-68 (2011).
- Chen, Q., Levine, M. M., et al. . New Generation Vaccines. , 306-315 (2009).
- Lai, H., et al. Monoclonal antibody produced in plants efficiently treats West Nile virus infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2419-2424 (2010).
- Buswell, S., Medina-Bolivar, F., Chen, Q., Van Cott, K., Zhang, C. Expression of porcine prorelaxin in transgenic tobacco. Annals of the New York Academy of Sciences. 1041, 77-81 (2005).
- Lico, C., Chen, Q., Santi, L. Viral vectors for production of recombinant proteins in plants. J. Cell. Physiol. 216, 366-377 (2008).
- Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Hum. Vaccin. 7, 331-338 (2011).
- Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
- Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97, 11984-11989 (2000).
- Lai, H., He, J., Engle, M., Diamond, M. S., Chen, Q. Robust production of virus-like particles and monoclonal antibodies with geminiviral replicon vectors in lettuce. Plant Biotechnology Journal. 10, 95-104 (2012).
- Giritch, A., et al. Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14701-14706 (2006).
- Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714 (2009).
- Santi, L., et al. An efficient plant viral expression system generating orally immunogenic Norwalk virus-like particles. Vaccine. 26, 1846-1854 (2008).
- He, J., Lai, H., Brock, C., Chen, Q. A Novel System for Rapid and Cost-Effective Production of Detection and Diagnostic Reagents of West Nile Virus in Plants. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 1-10 (2012).
- Huang, Z., et al. High-level rapid production of full-size monoclonal antibodies in plants by a single-vector DNA replicon system. Biotechnol. Bioeng. 106, 9-17 (2010).
- Kuta, D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4, 752-757 (2005).
- Phoolcharoen, W., et al. Expression of an immunogenic Ebola immune complex in Nicotiana benthamiana. Plant Biotechnology Journal. 9, 807-816 (2011).
- Phoolcharoen, W., et al. A nonreplicating subunit vaccine protects mice against lethal Ebola virus challenge. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 20695-20700 (2011).
- Herbst-Kralovetz, M., Mason, H. S., Chen, Q. Norwalk virus-like particles as vaccines. Expert Rev. Vaccines. 9, 299-307 (2010).
- Chen, Q., et al. Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins. Adv. Tech. Biol. Med. 1, 103 (2013).
