Sox10 içinde Kraniyofasiyal Kalkınma Görselleştirme: kaede Transgenik Zebra balığı Hattı Time-lapse konfokal mikroskopi kullanılarak
Summary
Deneysel verilerin görselleştirilmesi bilimsel topluluk sonuçların sunulması önemli bir unsur haline gelmiştir. Büyüyen embriyoların canlı time-lapse kayıt Üretimi karmaşık bir gelişimsel süreçlerinin daha iyi tanıtımı ve anlaşılmasına katkıda bulunmaktadır. Bu protokol Zebrafish kaede protein Fotoçevrim yoluyla hücre etiketleme için bir adım-adım bir kılavuzdur.
Abstract
Omurgalı palatogenesis kranial nöral (CNC) hücreleri, yakınsama ve yüz çıkıntıların uzantısı ve kraniofasiyal iskeletin olgunlaşması geçişini içeren bir derece koreografi ve karmaşık bir gelişimsel süreçtir. Kaede transgenik Zebrafish hattı oluşturuldu: Zebrafish damak belirli bölgelerde bir sox10 için kranial nöral katkısını incelemek. Sox10 böylece geleneksel boya veya raportör mRNA enjeksiyon daha hassas süreci etiketleme hücreyi yapma, nöral için kaede raportör protein soy kısıtlama sağlar. Kaede fotoğraf aktivasyonu sonrası yeşilden kırmızıya döner ve mümkün hassas hücrelerin takip yapan bir fotoğraf konvertibl proteindir. Sox10: kaede transgenik çizgi çene elemanlarının karşı maksiller doğuran ve amniotes için yüz çıkıntıların homoloji göstermektedir CNC hücre popülasyonlarının belirginleştiren soy analizini gerçekleştirmek için kullanılmıştır. Bu protokol basamağını açıklayankaede Zebra balığı embriyosu: Bir sox10 canlı zaman atlamalı video üretmek için s. Etmoid plaka Kalkınma pratik bir örnek olarak hizmet verecek. Bu protokol, transjenik zebrabalıkları herhangi kaede veya benzeri photoconvertible raportör proteinin bir zaman atlamalı konfokal kayıt yapmak için uygulanabilir. Ayrıca, zebra balığı mutantlar kraniofasial yapıları, normal, aynı zamanda anormal değildir gelişimi yakalamak için kullanılabilir.
Introduction
Orofasiyal yarıklar 1/700-1 ile, en yaygın kraniofasiyal deformitesi temsil, 000 teslimatlar 1 etkiledi. Erken embriyolojik kraniofasiyal gelişme bozulması yarık dudak ve damak (CL / P) oluşumuna yol açabilir. Sendrom yarık için nedenler büyük ölçüde gösterilmiş olmasına rağmen, orofasial yarıklaşmanın nonsendromik formlarının genetik ve epigenetik bazlar arasında hala 2-4 açık olması gerekir. Bu malformasyonların etyolojisi ve patogenezi anlamak için, bir hücresel bazda kraniofasial yapıların gelişmesini aydınlatmak için gereklidir.
Tüm omurgalı türlerin kranial nöral krest hücreleri (CNCC) orofasiyal yapıların oluşumuna katkıda yutak kemerler, doldurmak için dorsal nöral tüp göç. Erken embriyolojik nöral krest gelişim bozulması CL / P 5-7 gibi kraniofasiyal malformasyonların oluşumuna yol açabilir.
ReklamdaZebra balığı ve memeli kraniofasial geliştirme (CNCCs homolog bölgelerinde ikamet) arasındaki yapısal benzerlikler dition, gen düzenleyici ağ son derece muhafaza edilir. Ayrıca CNCCs Zebra balığı CL / P. gelişimsel ve genetik temelin çalışma için güçlü bir organizma haline amniote türler ve zebrabalıkları 8 ile aynı şekilde geliştirmek olduğu gösterilmiştir Bu küçük boyutlu, hızlı ve ex-utero embriyonik gelişim ve yüksek üreme oranları gibi birçok avantajı vardır. Ayrıca, embriyo mikroskop altında 9 karmaşık bir gelişimsel olayların gözlem it yatkın hale optik olarak transparandır. Bu göç ve kafatası nöral tepe hücreleri farklılaşma çalışma için ideal bir hayvan modelidir.
Kaede transgenik model 5: önce basılmış olan çalışmaları 8, 10, 11,, CNCC of göç desen üzerinde genişletilmesi sox10 kullanılarak detaylı bir şekilde tarif edilmiştir. Kaede fotoğraf konvertibl protein olduğunu tufotoğraf aktivasyon sonra yeşilden kırmızıya rns ve mümkün tam CNCCs iz yapar. Bu dönüşüm sırasında, peptid omurgası dönüşüm hücrelerin nihai hedefe 12 için izlenebilir, yani stabil olduğunu düşündürmektedir bölünmektedir. Sox10 transkripsiyonel kontrolü altında kaede ile etiketlenmiş transjenik çizgiler amniote damak ve zebrafish etmoid levha Y şekilli birleşme dikiş arasında benzer olan frontonasal öne (FNP) ile ve iki taraflı maksiller çıkıntıların (MXP) füzyonu ile homolog meydana gösterdi türleri.
Diğer uygulamalar arasında, sox10: kaede transgenik zebra balığı modeli normal ve anormal kraniofasial yapıların oluşumunu göstermek için farklı bir gelişim aşamalarında zebra balığı embriyoların videoları oluşturmak için kullanıldı. Hücrelerin spesifik grupların Fotoçevrim mümkün onların gelişimini takip etmek için yapar. Craniofac gelişen canlı görüntüleme oluşturmak için bu yöntemle bir yaklaşım ileZebrafish ial yapılar kolay görsel Bu karmaşık bir gelişimsel süreci göstermek için yapım tanıtıldı.
Örnek olarak kaede transgenik zebra balığı: Bu protokol sox10 de etmoid plakanın normal gelişimini kullanarak bu videoları üreten deneyim paylaşımı amaçlanıyor. Bu protokol ayrıca zebrabalıkları kranial nöral krest hücrelerinden türetilen herhangi bir yapının zaman atlamalı videoları hale uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
İşte Zebrafish modelinde kraniofasiyal gelişme görüntülenmesi için yeni bir yöntem gösterilmektedir. Sox10: kaede transgenik zebra balığı hattı başarıyla ayrıntılı CNCC arasında göç desen tanımlamak için kullanılan bir model organizma 5 olarak kullanılır.
Önceki çalışmalar hücrelerini hedef göz gibi brüt işaretlerini kullanmış ve kaede mRNA enjeksiyon, Fotoçevrim tahlillerde veya Fotoçevrim 10, 11, 14, 15 için kafesli floresein dek…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar nazik Zebrafish sox10 organizatörü ayıracı paylaşmak için Robert Kelsh teşekkür ederim.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| sox10: kaede transgenic zebrafish line | MGH | Available via the Liao lab | |
| Petri dishes 100×15 mm | BD Falcon | 351029 | |
| Petri dishes 35 mmx10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Ultrapure Low melting point (LMP) Agarose | Invitrogen | 15517022 | |
| Lab Tek 2 Chamber SlideSystem | LabTek | 154453 | |
| Microloaders 200/pk | Fisher | E5242956003 | |
| Nikon A1R Si Confocal Ti series | Nikon | No Catalog number | |
| NIS Elements Software AR3.2 64-bit | Nikon | No Catalog number |
Referências
- . Prevalence at Birth of Cleft Lip With or Without Cleft Palate: Data From the International Perinatal Database of Typical Oral Clefts (IPDTOC). Cleft Palate Craniofac. J. 48 (1), 66-81 (2011).
- Dixon, M. J., et al. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nat. Rev. Genet. 12 (3), 167-178 (2011).
- Mangold, E., Ludwig, K. U., Nothen, M. M. Breakthroughs in the genetics of orofacial clefting. Trends Mol. Med. 17 (12), 725-733 (2011).
- Kimmel, C. B., Miller, C. T., Moens, C. B. Specification and morphogenesis of the zebrafish larval head skeleton. Dev. Biol. 233 (2), 239-257 (2001).
- Dougherty, M., et al. Embryonic Fate Map of First Pharyngeal Arch Structures in the sox10: kaede Zebrafish Transgenic Model. J. Craniofac. Surg. 23 (5), 1333-1337 (2012).
- Trainor, P. A., Krumlauf, R. Hox genes, neural crest cells and branchial arch patterning. Curr. Opin. Cell Biol. 13 (6), 698-705 (2001).
- Schilling, T. F., Kimmel, C. B. Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo. Development. 120 (3), 483-494 (1994).
- Swartz, M. E., et al. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev. Dyn. 240 (9), 2204-2220 (2011).
- McCollum, C. W., et al. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth Defects Res. C. Embryo Today. 93 (2), 67-114 (2011).
- Wada, N., et al. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132 (17), 3977-3988 (2005).
- Eberhart, J. K., et al. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133 (6), 1069-1077 (2006).
- Ando, R., et al. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1993).
- Kawakami, A., et al. The zebrafish-secreted matrix protein you/scube2 is implicated in long-range regulation of hedgehog signaling. Curr. Biol. 15 (5), 480-488 (2005).
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell tracking using photoconvertible proteins during zebrafish development. J. Vis. Exp. (67), e4350 (2012).
