Эффективный метод обвалки Руководство Подготовиться Интактные Мышь носовой ткани с сохранением анатомической организации
Abstract
Млекопитающих нос многофункциональный орган со сложными внутренними структурами. Полость носа выстлана эпителием различные, такие как обонятельные, дыхательной и плоского эпителия которые существенно отличаются по анатомической локализации, морфологии и функции. У взрослых мышей, нос покрыты различными костей черепа, ограничивающий экспериментальных доступ к внутренней структуре, особенно в задней такие как основной обонятельный эпителий (МО). Здесь мы опишем эффективный метод получения почти весь и сохранности носовых тканей с сохранением анатомической организации. Использование хирургических инструментов при вскрытии микроскопом, мы последовательно удалить кости черепа окружающих тканей носа. Эта процедура может быть выполнена как на параформальдегиде фиксированной и недавно рассеченные, кожей руководители мыши. Вся процедура обвалки занимает приблизительно 20-30 мин, что значительно меньше, чем экспериментальный время, необходимое для обычной химической основе декальцификации. Кроме того, мы представляем простой способ для удаления пузырьков воздуха в ловушке между носовыми раковинами, которая имеет решающее значение для получения нетронутыми тонких горизонтальных или корональной или сагиттальных срезах из носовых подготовки ткани. Носовые ткани получают, используя наш метод может быть использован для наблюдения целого горе всей эпителия, а также морфологические, иммуноцитохимической, РНК в гибридизация и физиологических исследований, особенно в области исследований, в которых конкретные обследования и сравнения представляют интерес.
Introduction
Млекопитающих носовую полость содержит различные типы тканей и органов, которые служат различные функции. Носовой полости находится в передней части верхних дыхательных путей, что позволяет воздушным транспортом в и из легких. Ингаляционный воздух проходит через носовую полость, где он подвергается температуры и влажности воздуха 1, а также очистки или фильтрации для удаления раздражающих и токсичных веществ и инфекционные микроорганизмы 2. Обе процедуры осуществляются в виде назального эпителия и субэпителиальные тканей, в том числе желез и сосудов и критически важно для защиты нижних дыхательных путей и легких. В дополнение к его роль в дыхании и эпителиальных защиты, носовой ткани также содержит периферических сенсорных аппаратов обонятельной и тройничного систем, которые обнаружить широкий диапазон химических веществ в прохождении воздуха. В зависимости от системы, которая активирована, сенсорных обнаружения химических веществ в носу может вызвать либоОбоняние, раздражение или боль 3,4.
Периферийные обонятельная система сложна и состоит из нескольких анатомически отделены обонятельной сенсорных органов в полости носа. Среди них, основной обонятельный эпителий (МО) является самым большим, что составляет примерно 45-52% от назальный эпителий у грызунов 5 и расположена в задней области. В антеровентральном область, имеется пара трубчатых структур, известных как вомероназальный орган 6, который сидит вдоль каждой стороны носовой перегородки. Два дополнительных небольшими группами обонятельные сенсорные нейроны, известные как перегородки орган Masera 7,8 и 9 ганглий Грюнберг, проживающие вдоль вентральной перегородки и области спины входа полости носа соответственно. Эти периферические органы содержат нейроэпителий с отличительными особенностями в морфологии, экспрессии в клетках маркера, и физиологические функции. Вместе они обнаруживают тысячи запаховМолекулы с изысканной чувствительностью 10-12.
В дополнение к обонятельные органы чувств, носовой полости также находится других сенсорных систем. Известно, что пептидергические тройничного нерва волокна присутствуют в назальный эпителий, особенно дыхательный эпителий 13,14. Некоторые из этих волокон обнаружить раздражающих и токсичных химических веществ и ответственны за введение защитных рефлексов, таких как кашель и чихание 4,15. Раздражает пахучих и горьких соединений может быть обнаружена и на недавно обнаруженной населения хемосенсорным одиночные клетки (СОС), многие из которых иннервируются нервными волокнами тройничного 16-19. Эти кластеры с единым хранилищем находятся в более высокой плотности в записи область носовой полости и каналы вомероназальной входа, намекая, что они могут также выполняют защитную функцию 16-18. Таким образом, назальный эпителий может существенно отличаться в зависимости, морфологии и клеточного состава в зависимости от иханатомических местах.
Даже в пределах одного и специализированного эпителия, существуют региональные различия. МЧС является одним из таких примеров. МЧС линий различных раковин, которые сложны и свернулся структур. Из-за них, в разных частях МЧС опыт различных скоростях потока воздуха, и, таким образом, различные диффузии и освобожденных в воздухе молекулами запаха 20. Кроме того, известно, что обонятельной сенсорных нейронов (OSNs) экспрессии данного запах рецептор находится в одном из четырех обход зоны МО 21,22. Как это место разница влияет на ответы OSN на пахучие вещества в значительной степени неизвестны. Кроме того, некоторые OSN населения проявляют региональные предпочтения. Гуанилилциклазы-D (GC-D)-экспрессирующих OSNs имеют зональное распределение в пользу куль-де-мешок регионах ectoturbinates 23,24. Совсем недавно мы нашли субпопуляции канонической OSNs который выражает переходный рецепторный потенциал канала M5 (TRБДМ-5) и преимущественно расположены в поперечной и вентральной области 25. Эти результаты показывают, что МЧС не является единообразной. Тем не менее, как эти региональные различия влияют на обонятельные кодирование не поняли. Это отчасти потому, что тщательное физиологическое исследование МЧС и носа была ограничена трудностью получения нетронутыми носового эпителия с сохранением анатомической организации с использованием современных методов.
Носового эпителия преимущественно окруженный передних костей черепа, в том числе носовой, верхней челюсти, небных, скуловых и решетчатой костей. У взрослых мышей и других грызунов моделей, эти кости твердые и трудно удалить, не повреждая тесно связаны носовые ткани, в частности тонких раковин. Часто, на основе химических декальцинации используется для смягчения костей, чтобы cryosectioning носовых тканей для морфологического, иммуногистохимического и полевых исследованиях гибридизации, однако, зависимостьмости от возраста животного, декальцинации процесс может длиться в течение ночи до 7 дней 24,26-28. Это лечение также ограничена, поскольку она требует быть фиксатора ткани сохранились. Кроме того, химические декальцинации могут быть резкими и влияют на иммунную некоторых чувствительных антител 29,30. Для физиологических исследований, живой ткани не требуется, и, таким образом, эти эксперименты часто проводятся на изолированных OSNs МЧС или ломтиками, полученные из новорожденных, кости черепа тонкие и мягкие 17,31,32. Физиологические исследования могут также использовать весь препараты горе, разделив голову 25,33,34, но обычно только медиальной поверхности носа легко доступна, ограничивая физиологических записей на других областях.
Здесь мы описываем эффективные, ручной метод обвалки подготовить нетронутыми носовых тканей с сохранением оригинальной анатомической организации и морфологии. Мы последовательно удалить основные кости переднейЧереп при вскрытии микроскоп, чтобы подвергать почти полностью нетронутым носовом эпителии, сохраняя при этом тонкие кости носовой раковины нетронутым, если мыши не очень старые и cryosectioning необходима. Мы также распространить метод сохранить соединение между носовой ткани и обонятельной луковицы, а также в остальной части мозга, способствуя тем самым одновременном рассмотрении и периферических и центральных схем. Наш метод может быть использован для получения параформальдегиде-фиксированных, а также свежие, живые тканей носа. Таким образом, наш метод, как ожидается, для облегчения морфологических, иммуногистохимических и физиологические исследования дыхания, обоняния и носового повреждения и болезни.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы показали, шаг за шагом способ выделения нетронутыми обонятельной и дыхательной ткани от мыши носа путем последовательного удаления окружающих костей при щадящем ткани ниже. Мы покажем, что тщательное удаление кости может сохранить даже самые деликатные ткани в полном объеме….
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами исследований (NIH / NIDCD 009269, 012831 и ARRA административных дополнения NIH гранты) Weihong Лин. Мы особенно благодарны г-н Тим Форд на UMBC за техническую помощь в видеозаписи и обработки. Мы также хотели бы поблагодарить доктора Дафна Блумберг, г-жа Шер Петти в UMBC и г-н Николас McCollum с Олимпа Америка Инк для их оборудования помощь в видеозаписи.
Materials
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Dissection | |||
| Rongeur, 1.0 mm Jaw width | World Precision Instruments (WPI) | 501333 | |
| Fine forceps, Dumont 3 | WPI | 503235 | |
| Fine forceps, Dumont 55 | WPI | 14099 | |
| Fine forceps, Dumont AA | Fine Science Tools (FST) | 11210-20 | |
| Specimen forceps, Serrated | VWR | 82027-440 | |
| Operating scissors | WPI | 501753 | |
| Iris scissors, Straight | Miltex | V95-304 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZ40 | |
| [header] | |||
| Tissue embedding | |||
| Optimum cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Plastic embedding mold | VWR | 15160-215 | |
| Aspirator vacuum pump | Fisher Scientific | 09-960-2 | |
| [header] | |||
| Section staining | |||
| Neutral red | ACROS Organic | CAS 553-24-2 | Nuclei staining |
Referências
- Naclerio, R. M., Pinto, J., Assanasen, P., Baroody, F. M. Observations on the ability of the nose to warm and humidify inspired air. Rhinology. 45, 102-111 (2007).
- Bjermer, L. The nose as an air conditioner for the lower airways. Allergy. 54, 26-30 (1999).
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413, 211-218 (2001).
- Bryant, B., Silver, W. L. . Chemisthesis: The common chemical sense. , (2000).
- Gross, E. A., Swenberg, J. A., Fields, S., Popp, J. A. Comparative morphometry of the nasal cavity in rats and mice. J. Anat. 135, 83-88 (1982).
- Halpern, M. The organization and function of the vomeronasal system. Annu. Rev. Neurosci. 10, 325-362 (1987).
- Rodolfo-Masera, T. Su l’esquoestizenza di un particulare organo olfacttivo nel setto nasale della cavia e di altri roditori. Arch. Ital. Anat. Embryol. 48, 157-212 (1943).
- Levai, O., Strotmann, J. Projection pattern of nerve fibers from the septal organ: DiI-tracing studies with transgenic OMP mice. Histochemistry and Cell biology. 120, 483-492 (2003).
- Storan, M. J., Key, B. Septal organ of Gruneberg is part of the olfactory system. J. Comp. Neurol. 494, 834-844 (2006).
- Restrepo, D., Arellano, J., Oliva, A. M., Schaefer, M. L., Lin, W. Emerging views on the distinct but related roles of the main and accessory olfactory systems in responsiveness to chemosensory signals in mice. Horm. Behav. 46, 247-256 (2004).
- Breer, H., Fleischer, J., Strotmann, J. The sense of smell: multiple olfactory subsystems. Cell Mol. Life Sci. 63, 1465-1475 (2006).
- Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Subsystem organization of the mammalian sense of smell. Annu. Rev. Physiol. 71, 115-140 (2009).
- Finger, T. E., St Jeor, V. L., Kinnamon, J. C., Silver, W. L. Ultrastructure of substance P- and CGRP-immunoreactive nerve fibers in the nasal epithelium of rodents. J. Comp. Neurol. 294, 293-305 (1990).
- Papka, R. E., Matulionis, D. H. Association of substance-P-immunoreactive nerves with the murine olfactory mucosa. Cell Tissue Res. 230, 517-525 (1983).
- Baraniuk, J. N., Kim, D. Nasonasal reflexes, the nasal cycle, and sneeze. Curr. Allergy Asthma Rep. 7, 105-111 (2007).
- Lin, W., Ogura, T., Margolskee, R. F., Finger, T. E., Restrepo, D. TRPM5-expressing solitary chemosensory cells respond to odorous irritants. J. Neurophysiol. 99, 1451-1460 (2008).
- Ogura, T., et al. Cholinergic microvillous cells in the mouse main olfactory epithelium and effect of acetylcholine on olfactory sensory neurons and supporting cells. J. Neurophysiol. 106, 1274-1287 (2011).
- Finger, T. E., et al. Solitary chemoreceptor cells in the nasal cavity serve as sentinels of respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8981-8986 (2003).
- Gulbransen, B. D., Clapp, T. R., Finger, T. E., Kinnamon, S. C. Nasal solitary chemoreceptor cell responses to bitter and trigeminal stimulants in vitro. J. Neurophysiol. 99, 2929-2937 (2008).
- Zhao, K., Dalton, P., Yang, G. C., Scherer, P. W. Numerical modeling of turbulent and laminar airflow and odorant transport during sniffing in the human and rat nose. Chemical Senses. 31, 107-118 (2006).
- Ressler, K. J., Sullivan, S. L., Buck, L. B. A zonal organization of odorant receptor gene expression in the olfactory epithelium. Cell. 73, 597-609 (1993).
- Vassar, R., Ngai, J., Axel, R. Spatial segregation of odorant receptor expression in the mammalian olfactory epithelium. Cell. 74, 309-318 (1993).
- Fulle, H. J., et al. A receptor guanylyl cyclase expressed specifically in olfactory sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 3571-3575 (1995).
- Juilfs, D. M., et al. A subset of olfactory neurons that selectively express cGMP-stimulated phosphodiesterase (PDE2) and guanylyl cyclase-D define a unique olfactory signal transduction pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 3388-3395 (1997).
- Lin, W., Arellano, J., Slotnick, B., Restrepo, D. Odors detected by mice deficient in cyclic nucleotide-gated channel subunit A2 stimulate the main olfactory system. The Journal of Neuroscience: The Official journal of the Society for Neuroscience. 24, 3703-3710 (2004).
- Ishii, T., Omura, M., Mombaerts, P. Protocols for two- and three-color fluorescent RNA in situ hybridization of the main and accessory olfactory epithelia in mouse. J. Neurocyt. 33, 657-669 (2004).
- Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X., Ma, M. Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice. Chemical Senses. 34, 695-703 (2009).
- Packard, A., Schnittke, N., Romano, R. A., Sinha, S., Schwob, J. E. DeltaNp63 regulates stem cell dynamics in the mammalian olfactory epithelium. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 8748-8759 (2011).
- Matthews, J. B., Mason, G. I. Influence of decalcifying agents on immunoreactivity of formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Histochem J. 16, 771-787 (1984).
- Athanasou, N. A., Quinn, J., Heryet, A., Woods, C. G., McGee, J. O. Effect of decalcification agents on immunoreactivity of cellular antigens. J. Clin. Pathol. 40, 874-878 (1987).
- Hegg, C. C., Irwin, M., Lucero, M. T. Calcium store-mediated signaling in sustentacular cells of the mouse olfactory epithelium. Glia. 57, 634-644 (2009).
- Spehr, M., et al. Essential role of the main olfactory system in social recognition of major histocompatibility complex peptide ligands. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 1961-1970 (2006).
- Ma, M., Chen, W. R., Shepherd, G. M. Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation. J. Neurosci. Methods. 92, 31-40 (1999).
- Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing responses of mouse olfactory sensory neurons using the air-phase electroolfactogram recording. J. Vis. Exp. (37), e1850 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
- Lin, W., Margolskee, R., Donnert, G., Hell, S. W., Restrepo, D. Olfactory neurons expressing transient receptor potential channel M5 (TRPM5) are involved in sensing semiochemicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 2471-2476 (2007).
- Lin, W., Ezekwe, E. A., Zhao, Z., Liman, E. R., Restrepo, D. TRPM5-expressing microvillous cells in the main olfactory epithelium. BMC Neurosci. 9, 114 (2008).
- Ogura, T., Krosnowski, K., Zhang, L., Bekkerman, M., Lin, W. Chemoreception regulates chemical access to mouse vomeronasal organ: role of solitary chemosensory cells. PLoS One. 5, e11924 (2010).
- Sathyanesan, A., Feijoo, A. A., Mehta, S. T., Nimarko, A. F., Lin, W. Expression profile of G-protein βγ subunit gene transcripts in the mouse olfactory sensory epithelia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 84 (2013).
