En effektiv Manuel Afbening metode til at forberede Intakt Mouse næsevæv med bevaret Anatomisk Organization

Abstract

Pattedyr næse er en multi-funktionel orgel med indviklede interne strukturer. Næsehulen er foret med forskellige epitheler såsom olfaktoriske, luftveje og pladeepitel, der afviger markant i anatomiske steder, morfologi, og funktioner. Hos voksne mus, er næsen dækket med forskellige kranieknogler, begrænser eksperimentel adgang til interne strukturer, især i den bageste som den i hovedsagen lugtepithelet (MOE). Her beskriver vi en effektiv metode til opnåelse af næsten hele og intakt nasale væv med konserverede anatomisk organisation. Brug kirurgiske redskaber under et dissektionsmikroskop, vi sekventielt fjerne kraniet knogler omkring den nasale væv. Denne procedure kan udføres på begge paraformaldehydet-faste og frisk dissekeret, flået mus hoveder. Hele udbening tager ca 20-30 min, hvilket er betydeligt kortere end den eksperimentelle tid, der kræves til konventionel kemisk-baserede deforkalkning. Derudover præsenterer vi en nem metode til at fjerne luftbobler fanget mellem turbinates, som er afgørende for at opnå intakte tynde vandrette eller koronale eller sagittale sektioner fra den nasale væv forberedelse. Nasal væv fremstillet ved hjælp af vores metode kan anvendes til hel mount observation af hele epithel, samt morfologiske, immuncytokemiske, RNA in situ hybridisering og fysiologiske studier, især i studier, hvor region-specifik undersøgelse og sammenligning er af interesse.

Introduction

Pattedyrs næsehulen indeholder forskellige typer af væv og organer, der tjener forskellige funktioner. Næsehulen udgør indløbsdelen af ​​de øvre luftveje, der tillader luft rejser ind og ud af lungerne. Inhaleret luft passerer gennem næsehulen, hvor det gennemgår temperatur og fugtighed condition ¹ samt rengøring eller filtrering at fjerne irriterende og giftige stoffer og smitsomme mikroorganismer ^2. Begge behandlinger udføres af næse-epitel og subepithelial væv, herunder kirtler og fartøjer og er afgørende for at beskytte de nedre luftveje og lungerne. Ud over sin rolle i respiration og epithelial forsvar, også den nasale væv indeholder perifere sensoriske apparater af olfaktoriske og trigeminal systemer, som detekterer en bred vifte af kemiske stoffer i den passerende luft. Afhængig af hvilket system er aktiveret, kan sensoriske påvisning af kemikalier i næsen fremkalde entenen lugtesans, irritation eller smerter ^3,4.

Den perifere olfaktoriske system er komplekst og består af flere anatomisk adskilte olfaktoriske sanseorganer i næsehulen. Blandt dem er den vigtigste lugtepithelet (MOE) den største, som udgør ca 45-52% af næse-epitel hos gnavere ⁵ og er placeret i den bageste region. I anteroventral region, er der et par af rørformede strukturer kendt som vomeronasale organ ^6, som sidder langs hver side af næseskillevæggen. To yderligere små grupperinger af olfaktoriske sensoriske neuroner, kendt som septal organ Masera ^7,8 og Gruneberg ganglion ⁹ opholde sig sammen ventrale septum og den dorsale indgangsområdet af næsehulen, hhv. Disse perifere organer indeholder neuro-epiteler med karakteristiske træk i morfologi, cellemarkør udtryk, og fysiologiske funktioner. Sammen vil de opdage tusindvis af lugtmolekyler med udsøgt følsomhed ^10-12.

Ud over de olfaktoriske sanseorganer, også næsehulen huser andre sensoriske systemer. Det er kendt, at peptiderge trigeminale nerve fibre er til stede i den nasale epitel, især det respiratoriske epitel ^13,14. Nogle af disse fibre registrerer irriterende og giftige kemikalier og er ansvarlige for at indlede beskyttende reflekser såsom hoste og nysen ^4,15. Irriterende lugtende og bitre forbindelser kan også påvises ved en nyligt opdaget population af ensomme chemosensory celler (SCC'er), hvoraf mange er innerveres af trigeminus nervefibre ^16-19. Disse SCC'er er placeret i højere tæthed i posten region næsehulen og vomeronasale indrejse kanaler, antyder, at de også kan tjene en beskyttende funktion ^16-18. Således kan næse-epitel væsentlige forskelle i funktion, morfologi og cellesammensætning afhængig af deresanatomiske steder.

Selv inden for en enkelt og specialiseret epitel, er der regionale forskelle. MOE er et sådant eksempel. De MOE linjer forskellige turbinates, som er komplicerede og krøllede strukturer. På grund af dem, regioner forskellige fra de MOE opleve forskellige luftmængder, og dermed forskellige diffusion og clearance af luftbårne lugtmolekylerne ^20. Desuden er det kendt, at olfaktoriske sensoriske neuroner (OSN) udtrykker en given lugt receptor er placeret i en af fire omgås zoner MOE ^21,22. Hvordan dette sted forskel påvirker en OSN reaktion på lugtstoffer stort set ikke kendt. Desuden udviser nogle OSN populationer regional præference. Guanylylcyclase-D (GC-D)-udtrykkende OSN har zoneinddeles fordelinger begunstige cul-de-sac regioner af ectoturbinates ^23,24. For nylig fandt vi en delpopulation af kanoniske OSN der udtrykker transient receptor potentiale kanal M5 (trPM5) og fortrinsvis placeret i de laterale og ventrale regioner ^25. Disse resultater indikerer, at MOE er ikke ensartet. Men hvordan disse regionale forskelle påvirker olfaktoriske kodning ikke forstået. Dette er til dels fordi grundig fysiologisk undersøgelse af MOE og næse er blevet begrænset af vanskeligheden ved at opnå intakt næse-epitel med bevaret anatomisk organisation ved hjælp af gængse metoder.

Af næse-epitel overvejende omgivet af de forreste knoglerne i kraniet, herunder nasal, overkæben, Palatine, zygomatic og ethmoid knogler. Hos voksne mus og andre gnavere modeller, er disse ben hård og vanskelig at fjerne uden at beskadige tæt forbundet nasal væv, især de fine turbinates. Ofte er kemisk-baserede afkalkning bruges til at blødgøre knoglerne til at tillade cryosectioning nasale væv til morfologiske, immunhistokemiske og in situ hybridisering undersøgelser, men afhænding af alderen på dyret, kan afkalkning processen sidste overnatning op til 7 dage ^24,26-28. Denne behandling er også begrænset, fordi det kræver væv være fiksativ bevarede. Derudover kan kemisk afkalkning være barske og påvirke immunolabeling visse følsomme antistoffer ^29,30. Til fysiologiske studier, er levende væv kræves, og dermed er disse eksperimenter ofte udført på isolerede OSN eller MOE skiver opnået fra nyfødte, hvis kranium knogler er tynd og blød ^17,31,32. Fysiologiske undersøgelser kan også udnytte hele mount forberedelser spaltning af hovedet ^25,33,34, men som regel kun den mediale flade af næsen er let tilgængelig, hvilket begrænser fysiologiske optagelser på andre områder.

Her beskriver vi en effektiv, manuel udbening fremgangsmåde til fremstilling af intakte nasale væv med bevaret oprindelige anatomiske organisation og morfologi. Vi sekventielt fjerne de store knogler i forrestekranium under en dissektion mikroskop for at eksponere en næsten fuldstændig intakt næseepitelet samtidig holde de tynde turbinatceller knogler intakt medmindre musene er meget gammel og cryosectioning er nødvendig. Vi har også udvide den metode til at bevare forbindelsen mellem de nasale væv og olfaktoriske pærer, samt resten af ​​hjernen, således lette samtidig behandling af både perifere og centrale kredsløb. Vores metode kan anvendes til at fremstille paraformaldehyd-fikseret, samt frisk, levende nasal væv. Således er vores metode forventes at lette morfologiske, immunhistokemiske og fysiologiske studier af respiration, lugtesansen, og nasal skade og sygdom.

Protocol

1.. Mus Næse Forberedelse Vi brugte voksne C57BL / 6 baggrund mus i denne undersøgelse. Alle dyrepleje og-procedurer er godkendt af Animal Care og brug udvalg (IACUC) i University of Maryland, Baltimore County. 1.1 Erhvervelse næsen fra paraformaldahyde-fikserede mus Figur 1. Knogler …

Representative Results

Med denne metode, kan vi pålideligt opnå næsten helt intakt nasal væv. 2A viser et billede af voksen nasal prøve fra en paraformaldehyd-fikseret hoved. I denne prøve, er alle fire sub-olfaktoriske sensoriske organer, herunder Moe, septal orgel, den Gruneberg ganglion og VNO, intakt. Desuden er det respiratoriske epithel og subepithelial væv, såsom kirtler og fartøjer, bevares. Vi har med succes anvendt denne metode i en række undersøgelser, hvor vi undersøgte morfologi, distribution, nerve i…

Discussion

Her har vi vist en trin-for-trin procedure til at isolere intakt olfaktoriske og respiratorisk væv fra mus næse ved sekventielt at fjerne de omgivende knogler mens skåne vævet nedenfor. Vi viser, at omhyggelig fjernelse af knogle kan bevare selv de mest sarte væv i deres helhed. Vi deler også indsigt i mulige ændringer af denne teknik, hvor vi isolerer både hjerne og næse væv sammen for at bevare nerven forbindelsen. Denne nye metode tilvejebringer et middel til at isolere hele olfaktoriske og respiratorisk v?…

Materials

Name	Company	Catalogue Number	Comments
			Dissection
Rongeur, 1.0 mm Jaw width	World Precision Instruments (WPI)	501333
Fine forceps, Dumont 3	WPI	503235
Fine forceps, Dumont 55	WPI	14099
Fine forceps, Dumont AA	Fine Science Tools (FST)	11210-20
Specimen forceps, Serrated	VWR	82027-440
Operating scissors	WPI	501753
Iris scissors, Straight	Miltex	V95-304
Dissection microscope	Olympus	SZ40
			[header]
			Tissue embedding
Optimum cutting temperature (OCT) compound	Sakura Finetek	4583
Plastic embedding mold	VWR	15160-215
Aspirator vacuum pump	Fisher Scientific	09-960-2
			[header]
			Section staining
Neutral red	ACROS Organic	CAS 553-24-2	Nuclei staining