שיטה ידנית פירוק עצמות אפקטיבית להכין רקמות האף מאוס שלמות עם ארגון האנטומי משומר
Abstract
האף של היונקים הוא איבר רב תפקודי עם מבנים פנימיים מורכבים. חלל האף הוא מצופה epithelia השונים כגון epithelia חוש הריח, נשימה, וקשקש אשר נבדלים במידה ניכרת במקומות אנטומיים, מורפולוגיה, ופונקציות. בעכברים בוגרים, האף מכוסה בעצמות גולגולת שונות, המגביל את הגישה ניסיונית למבנים פנימיים, במיוחד אלה בכזה אחורי כאפיתל ההרחה הראשי (משרד החינוך). כאן אנו מתארים שיטה יעילה להשגת כמעט בכל רקמות האף ושלמות עם ארגון האנטומי נשמר. שימוש בכלים כירורגיים תחת מיקרוסקופ לנתח, אנחנו ברצף להסיר את עצמות הגולגולת מקיפות את רקמות האף. הליך זה יכול להתבצע בשני ראשי עכבר paraformaldehyde-קבועים וטרי, גזורים עור. הליך פירוק העצמות של כל לוקח בערך 20-30 דקות, שהוא קצר יותר באופן משמעותי מהזמן הנדרש לדה הניסיונית מבוססת כימי הקונבנציונליתהסתיידות. בנוסף, אנו מציגים שיטה קלה כדי להסיר בועות אוויר שנלכדו בין turbinates, שהוא קריטי להשגת חלקים אופקיים או העטרה או sagittal דקים שלמים מהכנת רקמת האף. רקמת האף מוכנה באמצעות השיטה שלנו יכולה לשמש לכל תצפית הר כולו epithelia, כמו גם מורפולוגית, immunocytochemical, רנ"א הכלאה באתרו, ומחקרים פיסיולוגיים, במיוחד במחקרים שבם האזור ספציפית בדיקה והשוואה הן בעלי העניין.
Introduction
חלל האף היונקים מכיל סוגים שונים של רקמות ואיברים המשרתים פונקציות שונות. חלל האף מהווה חלק כניסתם של דרך הנשימה העליונה, המאפשרת נסיעות אוויר לתוך ומחוץ לריאות. שאיפת אוויר עובר דרך חלל האף שבו הוא עובר טמפרטורה ולחות אוויר 1, כמו גם ניקוי או סינון כדי להסיר חומרים רעילים ומעצבנים ומיקרואורגניזמים זיהומיות 2. שני הטיפולים מבוצעים על ידי האף epithelia ורקמות subepithelial, כולל בלוטות וכלי והנם קריטיים להגנה על דרכי הנשימה התחתונה והריאות. בנוסף לתפקידה בנשימה והגנת אפיתל, רקמות האף מכילה גם מנגנונים תחושתיים היקפיים של מערכות חוש הריח ומשולשות, אשר לזהות מגוון רחב של חומרים כימיים באוויר שעובר. תלוי באיזה מערכת מופעלת, גילוי חושי של כימיקלים באף יכול לעורר אוחוש הריח, גירוי או כאב 3,4.
מערכת ההרחה ההיקפית היא מורכבת ומורכב מכמה איברי חישה ריח מופרדים אנטומית בתוך חלל האף. ביניהם, אפיתל ההרחה הראשי (משרד החינוך) הוא הגדול ביותר, המהווה כ 45-52% מepithelia האף במכרסמים 5 והוא ממוקם באזור האחורי. באזור anteroventral, יש זוג מבנים צינוריים המכונים איבר יעקובסון 6, שיושב לאורך כל צד של מחיצת האף. שתי קבוצות נוספות קטנות של עצב סנסורי חוש הריח, המכונות איבר במחיצה של Masera 7,8 וגנגליון Gruneberg 9, מתגורר יחד מחץ הגחון ואזור כניסת הגב של חלל האף, בהתאמה. איברים היקפיים אלה מכילים נוירו epithelia עם מאפיינים בולטים במורפולוגיה, ביטוי תא דה מרקר, ותפקוד פיסיולוגי. יחד הם מזהים אלפי ריחמולקולות עם רגישות מעודנת 10-12.
בנוסף לאברי החישה הריח, חלל האף גם בתי מערכות חושיות אחרות. זה ידוע כי סיבי עצב משולש peptidergic נמצאים באפיתל באף, במיוחד אפיתל הנשימה 13,14. חלק מסיבים אלה לזהות כימיקלים רעילים ומעצבנים ואחראי לייזום רפלקסים הגנה כגון שיעול או התעטשות 4,15. יכולות גם להיות מזוהות תרכובות ריחניות ומריר מעצבנת על ידי אוכלוסייה שהתגלתה לאחרונה של תאים בודדים (chemosensory SCCs), שרבים מן מעוצבבים על ידי סיבי עצב משולש 16-19. SCCs אלה ממוקמים בצפיפות גבוהה יותר באזור הכניסה של חלל האף וצינורות הזנת vomeronasal, ורמז כי הם עשויים לשמש גם תפקיד הגנתי 16-18. לפיכך, אף epithelia יכול שונה באופן מהותי בתפקוד, מורפולוגיה, ובהרכב של תאים בהתאם להםמקומות אנטומיים.
אפילו בתוך האפיתל יחיד ומיוחד, שיש הבדלים אזוריים. משרד החינוך הוא דוגמה אחת כזו. קווי משרד החינוך turbinates השונים, שהם מסובכים ומסולסלים מבנים. בגללם, אזורים שונים של ספיקות האוויר השונות ניסיון מו, ובכך, דיפוזיה שונה ושיעורי פינוי של מולקולות ריח נישאות באוויר 20. כמו כן, ידוע כי עצב סנסורי חוש הריח (OSNs) מבטא רצפטור ריח נתון נמצאים באחד מארבעת אזורים של לעקוף 21,22 משרד החינוך. איך זה משפיע על הבדל מיקום לא ידועה התגובה של OSN לodorants במידה רבה. בנוסף, חלק מאוכלוסיות OSN מפגינות העדפה אזורית. יש לי OSNs מבטא-Guanylyl cyclase-D (GC-D) הפצות אזוריות העדפת אזורי רחוב ללא מוצא של ectoturbinates 23,24. לאחרונה, מצאנו subpopulation של OSNs הקאנוניים שמבטא ערוץ פוטנציאל רצפטור החולף M5 (TRPM5) והוא ממוקם באזורים מועדף לרוחב וגחון 25. תוצאות אלו מצביעות על משרד החינוך שאינו אחיד. עם זאת, כמה הבדלים אזוריים אלה משפיעים על קידוד חוש הריח אינו מובן. מדובר בין השאר משום שהחקירה פיזיולוגית מעמיקה של משרד החינוך ואף הייתה מוגבלת על ידי קושי בהשגת שלמות באף epithelia עם ארגון האנטומי נשמר באמצעות שיטות קיימות.
האף epithelia מוקף בעיקר על ידי העצמות הקדמיות של הגולגולת, כולל האף, הלסת העליונה, הפלטין, הזיגומטית, ועצמות כברתי. בעכברים בוגרים ומודלים של מכרסמים אחרים, העצמות האלה קשות וקשות להסרה מבלי לפגוע ברקמת האף קשורה באופן הדוק, ובמיוחד את turbinates העדין. לעתים קרובות, משמש decalcification מבוסס כימי לריכוך עצמות כדי לאפשר cryosectioning של רקמות האף למורפולוגי, immunohistochemical, ובמחקרי הכלאה באתר, עם זאת, depenדינג בגילו של בעל החיים, התהליך יכול להימשך decalcification הלילה עד 7 ימים 24,26-28. טיפול זה הוא מוגבל גם מכיוון שהיא דורשת להיות רקמה מקבע השתמרה. בנוסף, decalcification הכימי יכול להיות קשה ולהשפיע immunolabeling של כמה נוגדנים רגישים 29,30. למחקרים פיסיולוגיים, נדרשת רקמה חי, ובכך, ניסויים אלה לעתים קרובות נערכים בOSNs מבודד או פרוסות המתקבלות ממשרד חינוך ילודים עצמות גולגולת שלהם הם דקים ורכות 17,31,32. מחקרים פיסיולוגיים יכולים גם לנצל את כל הכנות הר על ידי פיצול ראש 25,33,34, אך בדרך כלל רק המשטח המדיאלי של האף הוא נגיש בקלות, הגבלת הקלטות פיסיולוגיות בתחומים אחרים.
כאן, אנו מתארים שיטה יעילה פירוק עצמות, במדריך כדי להכין את רקמות האף שלמות עם השתמר ארגון האנטומי מקורי ומורפולוגיה. אנחנו ברצף להסיר את העצמות הגדולות של קדמייש צורך בגולגולת תחת מיקרוסקופ לנתיחה לחשוף אפיתל האף כמעט בשלמות לחלוטין, תוך שמירה על עצמות חלזוני דקות ללא פגע, אלא אם כן את העכברים הם ישנים מאוד וcryosectioning. אנחנו גם להרחיב את השיטה לשמירה על הקשר בין רקמות האף ונורות חוש הריח, כמו גם את שאר חלקי המוח, ובכך להקל בחינה בו זמנית של שני מעגלים היקפיים והמרכזיים. השיטה שלנו יכולה לשמש להכנת paraformaldehyde-קבוע, כמו גם טרי, רקמות האף חיים. לכן, השיטה שלנו צפויה להקל על מחקרים מורפולוגיים, immunohistochemical ופיסיולוגיים של נשימה, olfaction, ואף נזקים ומחלות.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו הפגנו הליך צעד אחר צעד לבידוד רקמת הרחה ונשימה ללא פגע מהאף העכבר על ידי רצף הסרת העצמות המקיפות תוך חוסך הרקמה להלן. אנו מראים כי הסרת עצם זהירה יכולה לשמר גם את הרקמות העדינות ביותר בשלמותם. כמו כן, אנו חולקים תובנות שינויים אפשריים של טכניקה זו, שבה אנו מבוד?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר (NIH / 009,269 NIDCD, 012,831 ומענקי NIH תוספת מנהליים ערה) לWeihong לין. תודה מיוחדת למר טים פורד בUMBC לקבלת הסיוע הטכני שלו בצילום וידאו ועיבוד. כמו כן, אנו רוצים להודות לד"ר דפנה בלומברג, גב 'Chere פטי בUMBC ומר ניקולס מק' קול מאולימפוס אמריקה בע"מ לסיוע הציוד שלהם בצילום וידאו.
Materials
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Dissection | |||
| Rongeur, 1.0 mm Jaw width | World Precision Instruments (WPI) | 501333 | |
| Fine forceps, Dumont 3 | WPI | 503235 | |
| Fine forceps, Dumont 55 | WPI | 14099 | |
| Fine forceps, Dumont AA | Fine Science Tools (FST) | 11210-20 | |
| Specimen forceps, Serrated | VWR | 82027-440 | |
| Operating scissors | WPI | 501753 | |
| Iris scissors, Straight | Miltex | V95-304 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZ40 | |
| [header] | |||
| Tissue embedding | |||
| Optimum cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Plastic embedding mold | VWR | 15160-215 | |
| Aspirator vacuum pump | Fisher Scientific | 09-960-2 | |
| [header] | |||
| Section staining | |||
| Neutral red | ACROS Organic | CAS 553-24-2 | Nuclei staining |
Referências
- Naclerio, R. M., Pinto, J., Assanasen, P., Baroody, F. M. Observations on the ability of the nose to warm and humidify inspired air. Rhinology. 45, 102-111 (2007).
- Bjermer, L. The nose as an air conditioner for the lower airways. Allergy. 54, 26-30 (1999).
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413, 211-218 (2001).
- Bryant, B., Silver, W. L. . Chemisthesis: The common chemical sense. , (2000).
- Gross, E. A., Swenberg, J. A., Fields, S., Popp, J. A. Comparative morphometry of the nasal cavity in rats and mice. J. Anat. 135, 83-88 (1982).
- Halpern, M. The organization and function of the vomeronasal system. Annu. Rev. Neurosci. 10, 325-362 (1987).
- Rodolfo-Masera, T. Su l’esquoestizenza di un particulare organo olfacttivo nel setto nasale della cavia e di altri roditori. Arch. Ital. Anat. Embryol. 48, 157-212 (1943).
- Levai, O., Strotmann, J. Projection pattern of nerve fibers from the septal organ: DiI-tracing studies with transgenic OMP mice. Histochemistry and Cell biology. 120, 483-492 (2003).
- Storan, M. J., Key, B. Septal organ of Gruneberg is part of the olfactory system. J. Comp. Neurol. 494, 834-844 (2006).
- Restrepo, D., Arellano, J., Oliva, A. M., Schaefer, M. L., Lin, W. Emerging views on the distinct but related roles of the main and accessory olfactory systems in responsiveness to chemosensory signals in mice. Horm. Behav. 46, 247-256 (2004).
- Breer, H., Fleischer, J., Strotmann, J. The sense of smell: multiple olfactory subsystems. Cell Mol. Life Sci. 63, 1465-1475 (2006).
- Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Subsystem organization of the mammalian sense of smell. Annu. Rev. Physiol. 71, 115-140 (2009).
- Finger, T. E., St Jeor, V. L., Kinnamon, J. C., Silver, W. L. Ultrastructure of substance P- and CGRP-immunoreactive nerve fibers in the nasal epithelium of rodents. J. Comp. Neurol. 294, 293-305 (1990).
- Papka, R. E., Matulionis, D. H. Association of substance-P-immunoreactive nerves with the murine olfactory mucosa. Cell Tissue Res. 230, 517-525 (1983).
- Baraniuk, J. N., Kim, D. Nasonasal reflexes, the nasal cycle, and sneeze. Curr. Allergy Asthma Rep. 7, 105-111 (2007).
- Lin, W., Ogura, T., Margolskee, R. F., Finger, T. E., Restrepo, D. TRPM5-expressing solitary chemosensory cells respond to odorous irritants. J. Neurophysiol. 99, 1451-1460 (2008).
- Ogura, T., et al. Cholinergic microvillous cells in the mouse main olfactory epithelium and effect of acetylcholine on olfactory sensory neurons and supporting cells. J. Neurophysiol. 106, 1274-1287 (2011).
- Finger, T. E., et al. Solitary chemoreceptor cells in the nasal cavity serve as sentinels of respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8981-8986 (2003).
- Gulbransen, B. D., Clapp, T. R., Finger, T. E., Kinnamon, S. C. Nasal solitary chemoreceptor cell responses to bitter and trigeminal stimulants in vitro. J. Neurophysiol. 99, 2929-2937 (2008).
- Zhao, K., Dalton, P., Yang, G. C., Scherer, P. W. Numerical modeling of turbulent and laminar airflow and odorant transport during sniffing in the human and rat nose. Chemical Senses. 31, 107-118 (2006).
- Ressler, K. J., Sullivan, S. L., Buck, L. B. A zonal organization of odorant receptor gene expression in the olfactory epithelium. Cell. 73, 597-609 (1993).
- Vassar, R., Ngai, J., Axel, R. Spatial segregation of odorant receptor expression in the mammalian olfactory epithelium. Cell. 74, 309-318 (1993).
- Fulle, H. J., et al. A receptor guanylyl cyclase expressed specifically in olfactory sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 3571-3575 (1995).
- Juilfs, D. M., et al. A subset of olfactory neurons that selectively express cGMP-stimulated phosphodiesterase (PDE2) and guanylyl cyclase-D define a unique olfactory signal transduction pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 3388-3395 (1997).
- Lin, W., Arellano, J., Slotnick, B., Restrepo, D. Odors detected by mice deficient in cyclic nucleotide-gated channel subunit A2 stimulate the main olfactory system. The Journal of Neuroscience: The Official journal of the Society for Neuroscience. 24, 3703-3710 (2004).
- Ishii, T., Omura, M., Mombaerts, P. Protocols for two- and three-color fluorescent RNA in situ hybridization of the main and accessory olfactory epithelia in mouse. J. Neurocyt. 33, 657-669 (2004).
- Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X., Ma, M. Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice. Chemical Senses. 34, 695-703 (2009).
- Packard, A., Schnittke, N., Romano, R. A., Sinha, S., Schwob, J. E. DeltaNp63 regulates stem cell dynamics in the mammalian olfactory epithelium. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 8748-8759 (2011).
- Matthews, J. B., Mason, G. I. Influence of decalcifying agents on immunoreactivity of formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Histochem J. 16, 771-787 (1984).
- Athanasou, N. A., Quinn, J., Heryet, A., Woods, C. G., McGee, J. O. Effect of decalcification agents on immunoreactivity of cellular antigens. J. Clin. Pathol. 40, 874-878 (1987).
- Hegg, C. C., Irwin, M., Lucero, M. T. Calcium store-mediated signaling in sustentacular cells of the mouse olfactory epithelium. Glia. 57, 634-644 (2009).
- Spehr, M., et al. Essential role of the main olfactory system in social recognition of major histocompatibility complex peptide ligands. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 1961-1970 (2006).
- Ma, M., Chen, W. R., Shepherd, G. M. Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation. J. Neurosci. Methods. 92, 31-40 (1999).
- Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing responses of mouse olfactory sensory neurons using the air-phase electroolfactogram recording. J. Vis. Exp. (37), e1850 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
- Lin, W., Margolskee, R., Donnert, G., Hell, S. W., Restrepo, D. Olfactory neurons expressing transient receptor potential channel M5 (TRPM5) are involved in sensing semiochemicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 2471-2476 (2007).
- Lin, W., Ezekwe, E. A., Zhao, Z., Liman, E. R., Restrepo, D. TRPM5-expressing microvillous cells in the main olfactory epithelium. BMC Neurosci. 9, 114 (2008).
- Ogura, T., Krosnowski, K., Zhang, L., Bekkerman, M., Lin, W. Chemoreception regulates chemical access to mouse vomeronasal organ: role of solitary chemosensory cells. PLoS One. 5, e11924 (2010).
- Sathyanesan, A., Feijoo, A. A., Mehta, S. T., Nimarko, A. F., Lin, W. Expression profile of G-protein βγ subunit gene transcripts in the mouse olfactory sensory epithelia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 84 (2013).
