En effektiv Manuell utbeining metode for å forberede Intakt Mouse Nasal Tissue med bevart Anatomisk Organization

Abstract

Pattedyr nese er en multi-funksjonelle organ med intrikate interne strukturer. Nesehulen er foret med ulike epitel som olfactory, luftveiene og plateepitel epitel som avviker markant i andre anatomiske områder, morfologi og funksjoner. I voksen mus, er nesen dekket med ulike skallen bein, noe som begrenser eksperimentell tilgang til interne strukturer, spesielt de i bakre som den viktigste lukteepitelet (MOE). Her beskriver vi en effektiv metode for å skaffe nesten hele og intakte nasal vev med bevart anatomisk organisasjon. Ved hjelp av kirurgiske verktøy under et dissekere mikroskop, vi sekvensielt fjerne skallen bein rundt nasal vev. Denne prosedyren kan utføres på begge paraformaldehyde-faste og ferske dissekert, flådd mus hoder. Hele prosedyren tar utbeiningen omtrent 20-30 min, som er vesentlig kortere enn den eksperimentelle tiden som kreves for konvensjonell kjemisk de-baserteforkalkninger. I tillegg presenterer vi en enkel metode for å fjerne luftbobler fanget mellom nesemusling, som er kritisk for å oppnå intakte tynne horisontale eller koronale eller sagittal seksjoner fra nasal vev forberedelse. Nasal vev fremstilt ved å anvende vår metode kan brukes til hel montere observasjon av hele epitel, samt morfologiske, immuncytokjemisk, RNA in situ hybridisering, og fysiologiske studier, spesielt i studier hvor region-spesifikke undersøkelse og sammenligning er av interesse.

Introduction

Pattedyr nesehulen inneholder ulike typer vev og organer som tjener forskjellige funksjoner. Nesehulen utgjør oppføring delen av øvre luftveier, noe som gjør at flytrafikken inn og ut av lungene. Inhalert luft passerer gjennom nesehulen hvor den gjennomgår temperatur og fuktighet conditioning ¹ samt rengjøring eller filtrering for å fjerne irriterende og giftige stoffer og smittsomme mikroorganismer ^to. Begge behandlingene blir utført av nasal epitel og subepithelial vev, inkludert kjertler og fartøy, og er avgjørende for å beskytte nedre luftveier og lungene. I tillegg til sin rolle i åndedrett og epitelial forsvar, inneholder den nasale vev også perifere sensoriske apparater olfactory og trigeminal systemer, som gjenkjenner en lang rekke kjemiske stoffer i den gjennomstrømmende luft. Avhengig av hvilken systemet er aktivert, kan sensorisk påvisning av kjemikalier i nesen fremkalle entenen følelse av lukt, irritasjon eller smerte ^3,4.

Det perifere luktsystemet er sammensatt og består av flere anatomisk atskilt olfactory sensoriske organer i nesehulen. Blant dem er den viktigste lukteepitelet (MOE) den største, som utgjør ca 45-52% av nasal epitel hos gnagere ^5, og ligger i den bakre regionen. I anteroventral regionen, er det et par av rørformede strukturer kjent som vomeronasal ⁶ organ, som sitter langs hver side av neseskilleveggen. Ytterligere to små grupperinger av olfactory sensoriske nevroner, kjent som septal organ Masera ^7,8 og Gruneberg ganglion ^9, bor langs ventral septum og dorsal oppføring regionen i nesehulen, henholdsvis. Disse perifere organer inneholder neuro-epitel med særpreg i morfologi, celle markør uttrykk, og fysiologiske funksjon. Sammen har de oppdage tusenvis av luktmolekyler med utsøkt følsomhet ^10-12.

I tillegg til de olfaktoriske sensoriske organer, huser nesehulen også andre sensoriske systemer. Det er kjent at peptidergic trigeminal nervefibre er til stede i det nasale epitel, spesielt det respiratorisk epitel ^13,14. Noen av disse fibrene oppdage irriterende og giftige kjemikalier og er ansvarlig for å initiere beskyttende reflekser som hoste og nysing ^4,15. Irriterer illeluktende og bitter forbindelser kan også bli oppdaget av en nylig oppdaget befolkning på ensomme chemosensory celler (SCCS), hvorav mange er innervated av trigeminal nerve fibre ^16-19. Disse SCCS er plassert i høyere tetthet i entry-regionen i nesehulen og vomeronasal oppføring kanaler, antydet at de kan også tjene en beskyttende funksjon ^16-18. Således kan nasale epitel vesentlig forskjellig i funksjon, morfologi, og celle sammensetning avhengiganatomiske steder.

Selv innen en enkelt og spesialisert epitel, det regionale forskjeller. MOE er et slikt eksempel. MOE linjer ulike nesemusling, som er kompliserte og krøllet strukturer. På grunn av dem, ulike regioner av MOE oppleve forskjellige luftmengder, og dermed forskjellig diffusjon og clearance av luftbårne lukt molekyler ^20. Dessuten er det kjent at olfactory sensoriske nevroner (OSNs) uttrykker en gitt lukt reseptor er plassert i en av fire omgått soner av MOE ^21,22. Hvordan dette stedet forskjellen påvirker en OSN respons på odorants er i stor grad ikke kjent. I tillegg er noen OSN populasjoner viser regional preferanse. Guanylyl cyclase-D (GC-D)-uttrykker OSNs har sonale distribusjoner favoriserer de Cul-de-sac regioner av ectoturbinates ^23,24. Flere nylig, fant vi en undergruppe av kanoniske OSNs som uttrykker transient receptor potential kanal M5 (trPM5) og fortrinnsvis er lokalisert i den laterale og ventrale regioner ^25. Disse resultatene indikerer at MOE ikke er ensartet. Men hvordan er disse regionale forskjellene påvirker olfactory koding ikke forstått. Dette er delvis fordi grundig fysiologisk undersøkelse av MOE og nesen har vært begrenset av vanskelighetene med å skaffe intakt nasal epitel med bevart anatomisk organisasjon med dagens metoder.

Nasal epitel er hovedsakelig omgitt av fremre bein i skallen, inkludert nasal, maxilla, palatine, zygomatic, og ethmoid bein. Hos voksne mus og andre gnagere modeller, disse beina er hardt og vanskelig å fjerne uten å skade nært knyttet nasal vev, spesielt den delikate nesemusling. Ofte er kjemisk-baserte decalcification brukes til å myke bein å tillate frysesnitt av nasal vev for morfologiske, immunhistokjemiske, og in situ hybridisering studier, men avhengighetding av alderen på dyret, kan decalcification prosessen vare over natten opptil 7 dager ^24,26-28. Denne behandlingen er også begrenset, fordi den krever vev være fiksativ-bevart. I tillegg kan kjemiske decalcification være harde og påvirke immunolabeling av enkelte sensitive antistoffer ^29,30. For fysiologiske studier, er levende vev som kreves, og dermed er disse forsøkene ofte utført på isolerte OSNs eller MOE skiver hentet fra nyfødte som skallen bein er tynne og myke ^17,31,32. Fysiologiske studier kan også benytte hele montere forberedelser ved å splitte hodet ^25,33,34, men vanligvis bare den mediale overflaten av nesen er lett tilgjengelig, noe som begrenser fysiologiske innspillinger på andre områder.

Her beskriver vi en effektiv, manuell utbeining metode for å forberede intakte nasal vev med bevart opprinnelige anatomisk organisasjon og morfologi. Vi sekvensielt fjerne de store bein av fremrehodeskallen under en disseksjon mikroskop for å avsløre en nesten helt intakt nasal epitel samtidig som de tynne turbinate bein intakt med mindre musene er svært gamle og frysesnitt er nødvendig. Vi kan også utvide metoden for å bevare forbindelsen mellom den nasale vev og olfaktoriske pærer, samt resten av hjernen letter således samtidig undersøkelse av både perifere og sentrale kretser. Vår fremgangsmåte kan anvendes for å fremstille para-formaldehyd-fast, så vel som friske, levende nasal vev. Således er vår fremgangsmåte forventes å lette morfologiske, fysiologiske og immunhistokjemisk studier av respirasjon, luktesans, og nasal skade og sykdom.

Protocol

En. Mus Nose Forberedelse Vi brukte voksne C57BL / 6 bakgrunn mus i denne studien. Alle dyr omsorg og prosedyrer er godkjent av Animal Care og bruk Committees (IACUC) av University of Maryland, Baltimore County. 1.1 Anskaffelse av nesen fra paraformaldahyde-faste mus Figur 1. Bein av en …

Representative Results

Ved hjelp av denne metoden kan vi sikkert få nesten helt intakt nasal vev. Figur 2A viser et bilde av voksen nasal prøven fra en Paraformaldehyde-fast hode. I denne prøven, alle fire sub-olfactory sensoriske organer, inkludert MOE, septal organ, Gruneberg ganglion, og VNO, er intakte. Dessuten er det respiratoriske epitel og subepithelial vev, for eksempel kjertler og fartøy, bevart. Vi har med hell brukt denne metoden i en rekke studier der vi undersøkte morfologi, distribusjon, nerve innervasjon,…

Discussion

Her viste vi en trinn-for-trinn prosedyre for å isolere intakt olfactory og respiratorisk vev fra mus nesen ved sekvensielt å fjerne de omkringliggende bein mens sparsom vevet under. Vi viser at forsiktig bein fjerning kan bevare selv de mest delikate vev i sin helhet. Vi deler også innsikt i eventuelle endringer i denne teknikk, der vi isolerer både i hjernen og nese vevet sammen for å bevare nerve forbindelsen. Denne nye metoden gir et middel for å isolere hele olfactory og respiratorisk vev i et enkelt eksempla…

Materials

Name	Company	Catalogue Number	Comments
			Dissection
Rongeur, 1.0 mm Jaw width	World Precision Instruments (WPI)	501333
Fine forceps, Dumont 3	WPI	503235
Fine forceps, Dumont 55	WPI	14099
Fine forceps, Dumont AA	Fine Science Tools (FST)	11210-20
Specimen forceps, Serrated	VWR	82027-440
Operating scissors	WPI	501753
Iris scissors, Straight	Miltex	V95-304
Dissection microscope	Olympus	SZ40
			[header]
			Tissue embedding
Optimum cutting temperature (OCT) compound	Sakura Finetek	4583
Plastic embedding mold	VWR	15160-215
Aspirator vacuum pump	Fisher Scientific	09-960-2
			[header]
			Section staining
Neutral red	ACROS Organic	CAS 553-24-2	Nuclei staining